厌氧氨氧化菌的特性与分类图文精.docx

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厌氧氨氧化菌的特性与分类图文精

厌氧氨氧化菌的特性与分类-图文（精）

]首先在一个处理酵母废水的反硝化中试装置内发现该反应过程.此后,人们陆续在海洋、河流、湖泊底泥等自然环境中检测出厌氧氨氧化反应,并认为它在氮素生物地

球化学循环中起着举足轻重的作用.据估计,其

氮气产量占海洋氮气释放量的３０％～５０％[３‐４

].在环境工程上,厌氧氨氧化反应已成功地应用于废水生物脱氮处理.据报道,在荷兰鹿特丹污水

处理厂,利用厌氧氨氧化工艺对污泥压滤液进行脱氮处理,反应器总氮去除率高达９.５kg爛m－３

爛

d

－１[５]

显示了诱人的应用前景.厌氧氨氧化的推

动者———厌氧氨氧化菌是一群分支很深的浮霉状菌,其特殊的细胞结构、代谢方式和进化地位引起了生物学家的高度关注.本文拟就厌氧氨氧化菌的研究进展作一综述.

１　厌氧氨氧化菌的特性

1畅1　个体形态特征

　　cw:

细胞壁;cm:

细胞膜;pa:

外室细胞质;icm:

胞质内膜;ri:

核糖细胞质;am:

厌氧氨氧化体膜;a:

厌氧氨氧化体.长箭头:

管状结构;短箭头:

电子密集颗粒.

图1　厌氧氨氧化菌细胞的超微结构图

Fig.１　Ultrastructureofanammoxbacterialcell

　　厌氧氨氧化菌形态多样,呈球形、卵形等,直径０畅８～１畅１μm[６

].厌氧氨氧化菌是革兰氏阴性菌.细胞外无荚膜.细胞壁表面有火山口状结构[

７]

少数有菌毛[

６]

.细胞内分隔成３部分:

厌氧氨氧化体（anammoxosome、核糖细胞质（ri

boplasm及外室细胞质（paryphoplasm.核糖细胞质中含有核糖体和拟核,大部分DNA存在于此[

８]

.该菌出芽生殖.

　　厌氧氨氧化体是厌氧氨氧化菌所特有的结构,占细胞体积的５０％～８０％,厌氧氨氧化反应在其内进行[

６]

.厌氧氨氧化体由双层膜包围,

该膜深深陷入厌氧氨氧化体内部[９

]（图１.厌氧氨氧化体不含核糖体,但含六角形的管状结构和电子密集颗粒.透射电镜及能谱仪分析表

明,这些电子密集颗粒中含有铁元素[９

].

1畅2　细胞壁和细胞膜化学组分特征

　　厌氧氨氧化菌的细胞壁主要由蛋白质组成,不含肽聚糖.细胞膜中含有特殊的阶梯烷膜脂,

由多个环丁烷组合而成,形状类似阶梯[１０

].在各种厌氧氨氧化菌中,阶梯烷膜脂的含量基本相似.疏水的阶梯烷膜脂与亲水的胆碱磷酸、乙醇胺磷酸或甘油磷酸结合形成磷脂,构成细胞膜的骨架.细胞膜中的非阶梯烷膜脂由直链脂肪酸、支链脂肪酸、单饱和脂肪酸和三萜系化合物组成.三萜系化合物包括C２７的藿烷类化合物

（hopanoi

d,细菌藿四醇（bacteriohopanetetrol,BHT和鲨烯（squalene,C３０H５０.其中,BHT首次发现于严格厌氧菌中[１１

].在不同厌氧氨氧化菌种中,非阶梯烷膜脂的种类和含量变化较大[１２

].曾一度认为阶梯烷膜脂只存在于厌氧氨氧化体的双层膜上,其功能是限制有毒中间产物的扩散.目前认为阶梯烷膜脂存在于厌氧氨氧化菌的所有膜结构上（包括细胞质膜,它们与非阶梯烷膜脂相结合,以确保其他膜结构的穿透性好

于厌氧氨氧化体膜[１０,１２]

.1畅3　富集培养与分离特征

　　厌氧氨氧化菌的富集培养选用自然样品作为接种物（如活性污泥、海洋底泥、土壤,按目标菌群所需的最佳生境条件,以含有适量基质和营养元素的培养液（表１在生物反应器中进行[７

].厌氧氨氧化菌生长缓慢,倍增时间１０～

３０d[８

].富集培养物呈红色,性状粘稠,含有较

多的胞外多聚物[１３]

.

　　厌氧氨氧化菌是一种难培养的微生物,采用系列稀释分离、平板划线分离、显微单细胞分离等传统微生物分离方法,均未分离成功.迄今为止,密度梯度离心法是成功分离厌氧氨氧化菌的唯一方法.其原理是通过离心使不同密度

的细菌细胞形成不同的沉降带[１４

].具体操作方法如下:

首先,用超声波温和破碎厌氧氨氧化菌富集培养物,将菌群分散成单个细胞;接着,离心去除残留的聚集体（生物膜或絮体碎片;最后,将分散的细胞用Percoll密度梯度离心,使厌氧氨氧化菌在离心管内形成一条深红色条带.采用该方法可获得高纯度的细胞悬液,每

２００～８００个细胞中可只含有１个污染细胞[１５

].

表1　富集厌氧氨氧化菌的营养元素组成Table１　Nutrientsusedforanammoxbacteriaenrichment

营养物质量浓度/（g爛L－１KH２PO４０畅０２７

CaCl２０畅１８

MgSO４爛７H２O０畅３

KHCO３０畅５

微量元素溶液ⅠEDTA５

FeSO４５

微量元素溶液ⅡEDTA１５

H３BO４０畅０１４

MnCl２爛４H２O０畅９９

CuSO４爛５H２O０畅２５

ZnSO４爛７H２O０畅４３

NiCl２爛６H２O０畅１９

NaMoO４爛２H２O０畅２２

NaSeO４爛１０H２O０畅２１

1畅4　生理生化特征

　　厌氧氨氧化菌为化能自养型细菌[７],以二氧化碳作为唯一碳源,通过将亚硝酸氧化成硝酸来获得能量,并通过乙酰‐CoA途径同化二氧化碳[１６].虽然有的厌氧氨氧化菌能够转化丙酸、乙酸等有机物质,但它们不能将其用作碳源[１７‐１８].厌氧氨氧化菌对氧敏感,只能在氧分压低于５％氧饱和（以空气中的氧浓度为１００％的条件下生存,一旦氧分压超过１８％氧饱和,其活性即受抑制,但该抑制是可逆的[１９‐２０].厌氧氨氧化菌的最佳生长pH范围为６畅７～８畅３,最佳生长温度范围为２０～４３℃[７].厌氧氨氧化菌对氨和亚硝酸的亲和力常数都低于１×１０－４gN爛L－１[１９].基质浓度过高会抑制厌氧氨氧化菌活性[１９,２１]（表２.

表2　基质对厌氧氨氧化菌的抑制浓度

Table２　Inhibitionconcentrationsofnitrogenoussubstratesonanammoxbacteriammol爛L－１

基　质抑制浓度半抑制浓度NH４＋‐N７０５５

NO２－‐N７２５

　　注:

半抑制浓度代表抑制５０％厌氧氨氧化活性的基质浓度.

　　１９９７年,vandeGraff等[２２]基于１５N示踪研究,提出了厌氧氨氧化菌代谢模型（图２;基于厌氧氨氧化菌基因组学和酶学研究,其他研究者[２３,６]对此代谢模型作了修正（图３.２种模型的最大区别在于:

前者认为亚硝酸的还原产物是羟氨（NH２OH,后者则认为亚硝酸的还原产物是NO.根据改进的模型,亚硝酸先被含有细胞色素c（CytC和细胞色素d１的亚硝酸还原酶（NiR还原成一氧化氮（NO２－＋e－NO;再由联氨水解酶（HH将一氧化氮与氨结合成联氨（NO＋NH４＋＋３e－N２H４;最后由联氨氧化酶（HZO或羟氨氧化还原酶（HAO将联氨氧化成氮气（N２H４N２＋４e－.在联氨氧化成氮气的过程中,可产生４个电子,这４个电子通过细胞色素c、泛醌、细胞色素bc１复合体以及其他细胞色素c传递给NiR和HH,其中３个电子传递给NiR,１个电子传递给HH.伴随电子传递,质子被排放至厌氧氨氧化体膜外侧,在该膜两侧形成质子梯度,驱动ATP合成[２３‐２８

].

图2　基于15N示踪研究的代谢途径

Fig.２　Metabolicpathwaybasedon１５Nstudy

　　HAO和HZO是厌氧氨氧化菌中研究的较为深入的２种酶.HAO广泛存在于好氧氨氧化细菌、反硝化细菌等微生物中,它不但能够催化羟氨氧化成亚硝酸,也能够将亚硝酸还原为羟氨,还能催化氧化联氨[１].从厌氧氨氧化菌中分离获得的HAO不同于从好氧氨氧化细菌中获得的HAO,它不能将羟氨转化成亚硝酸,只能将其转化成NO或N２O.已被纯化的HAO有２种,虽然两者的分子量和亚单位不同,但是均含大量c型血红素[１６个和（２６±４个]和P４６８细胞色素.该酶也能催化氧化联氨,

浙江大学学报（农业与生命科学版

但对羟氨的亲和力更强[２４,２６

]

（表３.HZO也已从厌氧氨氧化菌中分离纯化,它只能催化氧化联氨,不能催化氧化羟氨.但羟氨能与该酶结

合,从而对联氨产生竞争性抑制[２５

].

图3　基于基因组学和酶学的代谢途径

Fig.３　Metabolicpathwaybasedongenomicsandenzymology

表3　厌氧氨氧化菌HAO和HZO酶的特性

Table３　CharacteristicsofHAOandHZOpurifiedfromanammoxbacteria

性　质Brocadiaanammoxidans

HAOKSU‐１菌株

HZOHAO分子质量/ku１８３±１２１３０±１０１１８±１０亚单位/ku５８６２５３组成形态α３α２α２血红素含量２６±４１６１６细胞色素P４６８

P４７２P４６８氧化活性NH２OHμmax/（μm爛min－１

爛mg－１

２１aND９畅６aKm,Ki/μm２６a（Km２畅４b（Ki３３a（Km周转次数/min－１３畅９×１０３

NDNRN２H

４

μmax/（μm爛min－１爛mg－１

１畅１a６畅２b０畅５４akm/μm

１８a５畅５b２５a周转次数/min－１

２畅０×１０２

１畅７×１０２

NR

　　注:

a以PBS和MTT为电子受体;b

以细胞色素c为电子受体;ND:

未检出;NR:

未报道.

1畅5　生态学特征

　　目前发现的厌氧氨氧化菌有５个属,９个种[１８

]（图４.

待定厌氧氨氧化布罗卡地菌（CandidatusBrocadiaanammoxidans",

待定荧光布罗卡地菌（CandidatusBrocadiafulgida",待定斯图加特库氏菌（CandidatusKueneniastuttgartiensis",待定布罗达氏阶梯烷菌

（CandidatusScalinduabrodae",

待定韦格氏阶梯烷菌（CandidatusScalinduawagneri",待定亚洲杰特氏菌（CandidatusJetteniaasiatica",

待定丙酸厌氧氨氧化球菌（CandidatusAnammoxoglobuspropionicus",待定硫酸盐厌氧氨氧化球菌（CandidatusAnammoxoglobus

sulfate"分离自污水处理厂构筑物或实验室反

应器内[１７,２９‐３４]

;

待定黑海阶梯烷菌（CandidatusScalinduasorokinii"分离自海水中[３５

].检测表明,厌氧氨氧化菌也存在于海岸、浅滩、入河口的

底泥中.厌氧氨氧化菌的分布极其广泛[３６‐３８]

.　　由于厌氧氨氧化同时需要氨和亚硝酸２种基质,在实验室反应器中或在污水厂构筑物中,当溶解氧浓度较低时,厌氧氨氧化菌可与好氧氨氧化菌共同存在,互惠互利.好氧氨氧化菌产生的亚硝酸用作厌氧氨氧化菌的基质,而厌氧氨氧化菌消耗亚硝酸,则可解除亚硝酸对好氧

６

７４第３５卷　

郑平,张蕾,等:

厌氧氨氧化菌的特性与分类氨氧化菌的抑制[３９

].

　　对厌氧氨氧化菌的生态学研究主要依赖分子生物学手段,其中包括聚合酶链式反应（PCR、

变性梯度凝胶电泳（DGGE、克隆测序和荧光原位杂交（FISH.在厌氧氨氧化菌生态

学研究中常用的PCR引物[１７,３７,４０‐４２]

列于表

４.

图4　厌氧氨氧化菌的系统发育树

Fig.４　Phylogenetictreeofanammoxbacteria

表4　研究厌氧氨氧化菌生态学常用的PCR引物

Table４　PCRprimersusuallyusedinecologicalresearchofanammoxbacteria

目标菌群

上游引物名称

上游引物序列

下游引物名称下游引物序列

Pla４６F

５‐GACTTGCATGCCTAATCC‐３细菌通用引物６３０R

５‐CAKAAAGGAGGTGATCC‐３

浮霉状菌

Pla４６F５‐GACTTGCATGCCTAATCC‐３细菌通用引物１４０６R５‐ACGGGCGGTGTGTRC‐３Pla４６F５‐GACTTGCATGCCTAATCC‐３细菌通用引物１３９２R５‐ACGGGCGGTGTGTAC‐３厌氧氨氧化菌

Amx３６８F５‐CCTTTCGGGCATTGCGAA‐３细菌通用引物１３９２R５‐ACGGGCGGTGTGTAC‐３

Amx３６８F

５‐CCTTTCGGGCATTGCGAA‐３Amx８２０R５‐AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC‐３Amx８０９F５‐GCCGTAAACGATGGGCACT‐３

Amx１０６６R

５‐AACGTCTCACGACACGAGCTG‐３Amx８１８F

５‐ATGGGCACTMRGTAGAGGGGTTT‐３Amx１０６６R

５‐AACGTCTCACGACACGAGCTG‐３

２　厌氧氨氧化菌的分类

　　浮霉状菌目（Planctomycetales是细菌域中分化较早的一个分支.该目包括２个科,９个属,分别为Planctomyces,Pirellula,Gemmata,Isosphaera,CandidatusBrocadia,CandidatusKuenenia,CandidatusScalindua,CandidatusJettenia,CandidatusAnammoxoglobus.其中,前４个属归入浮霉状菌科（Planctomycetaceae,皆为化能异养型好氧菌,后５个属归入厌氧氨氧化菌科（Anammoxaceae,皆为化能自养型厌氧菌,并具有厌氧氨氧化功能

[４３‐４４]

.

2畅1　CandidatusBrocadiaanammoxidans　　该种发现于荷兰Gist‐Brocades污水处理

厂,名字中的Brocadia"、

anammoxidans"分别图5　CandidatusBrocadiaanammoxidans菌落的电

子显微镜照片

Fig.５　MicroscopicgraphofCandidatusBrocadia

anammoxidanscolonies

指发现地和代谢方式[

４５]

.它是第一个被富集鉴

定的厌氧氨氧化菌种,也是Candidatus

７

７４　第５期

４７８浙江大学学报（农业与生命科学版）第３５卷　Ｂｒｏｃａｄｉａ＂属的代表种．菌体呈球形，具有前述厌氧氨氧化菌的细胞结构特征，如细胞表面有火山口状结构，内含厌氧氨氧化体，无荚膜，无［７］鞭毛和菌毛（图５）．细胞膜含阶梯烷膜脂，约［１０］占细胞总脂类的３４％．以亚硝酸为能源，以二氧化碳为碳源，不能利用小分子有机酸类，如甲酸、丙酸等．倍增时间１１ｄ，最佳生长ｐＨ８，［７，４６］最佳生长温度４０℃．已从该菌体内分离获得分子量为（１８３±１２）ｋｕ的ＨＡＯ，并证明它能同时氧化羟氨和联氨［２４］．它在ＧｅｎＢａｎｋ中的注册号为ＡＦ３７５９９４．２畅２　ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＢｒｏｃａｄｉｆｕｌｄａａｇｉ　　该种发现于荷兰鹿特丹污水处理厂，名字中的ｆｕｌｄａ＂来源于英语中ｆｕｌｄ＂一词，ｇｉｇｉ意为灿烂的，闪耀的＂，因这种细菌形成的胞外多聚，１８物能够发光而命名［３０］．胞呈球形，直径细０畅７～１μｍ．该菌为化能自养型厌氧菌，以亚硝酸为能源，以二氧化碳为碳源，同时能以亚硝酸或硝酸为电子受体氧化甲酸、丙酸、单甲胺和二甲胺，但这些有机物并不用于细胞物质的合成［１８］．菌体具有前述厌氧氨氧化菌的细胞结构特征．在细胞膜中，阶梯烷膜脂占细胞总脂类［１１］６３％．１６ＳｒＲＮＡ序列分析表明，该菌与ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＢｒｏｃａｄｉａｎａｍｏｘｉａｄａｎｓ＂的相似性［１８］最高，９４％达．它在ＧｅｎＢａｎｋ中的注册号为ＤＱ４５９９８９．２畅３　ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＫｕｅｎｅｎｉｓｔｕｔｔａｇａｒｔｉｓｅｎｓｉ　　该种发现于生物滤池中，名字中Ｋｕｅｎｅｎｉａ＂是在厌氧氨氧化领域作出杰出贡献的荷兰微生物学家ＪＧｉｓＫｕｅｎｅｎ的姓氏，畅ｊｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｓ＂是该菌的发现地［３１］．ｅｎｓｉ该菌呈球状，直径１μｍ左右（图６）．化能自养型，不能利用甲酸、丙酸等有机酸．菌体具有前述厌氧氨氧化菌的细胞结构特征．在细胞中，阶梯烷膜脂占［１１］细胞总脂类的４５％．已从该菌体内分离获得ＨＡＯ和ＨＺＯ，前者能同时氧化羟氨和联氨，后者只能氧化联氨．该菌在ＧｅｎＢａｎｋ中的注册号为ＡＦ３７５９９５．２畅４　ＣａｎｄｉｕｓＳｃａｌｎｄｕａｂｒｏｄａｅ和ＣａｎｄｉｕｓｄａｔｉｄａｔＳｃａｌｎｄｕａｗａｇｎｅｒｉｉ　　两菌都发现于英国Ｐｉｔｓｅａ垃圾填埋场的污水处理厂，它们名字中的Ｓｃａｌｎｄｕａ＂表示细ｉ菌细胞中具有阶梯烷，ｂｒｏｄａｅ＂和ｗａｇｎｅｒｉ＂是为了纪念厌氧氨氧化反应的第一个预言者———奥地利理论化学家ＥｎｇｅｌｂｅｒｔＢｒｏｄａ以及为厌氧氨氧化菌生态学和系统发育学研究作出贡献［３２］的德国微生物学家ＭｉｃｈａｅｌＷａｇｎｅｒ而命名．两菌均为化能自养型的兼性厌氧菌．菌体呈球形，直径大约１μｍ（图７）．它们能以亚硝酸为电子受体氧化氨，以二氧化碳为唯一碳源；能将羟氨转化成联氨．菌体具有前述厌氧氨氧化菌的细胞结构特征，细胞膜含有阶梯烷膜脂，细胞内拥有厌氧氨氧化体．Ｓｃａｌｎｄｕａｂｒｏｄａｅ菌在ｉ落中，细胞排列松散；而在Ｓｃａｌｎｄｕａｗａｇｎｅｒｉｉ菌落中，细胞排列紧密．两菌之间１６ＳｒＲＮＡ序［３２］列的相似度为９３％．它们在ＧｅｎＢａｎｋ中的注册号分别为ＡＹ２５４８８３和ＡＹ２５４８８２．图７　Ｃａｎｄｉｕｓｄａｔ图６　ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＫｕｅｎｅｎｉｓｔｇａｒｔｉｓ菌落的电ａｕｔｔｅｎｓｉ子显微镜照片Ｆｉ．６　ＭｉｇｃｒｏｓｃｏｐｉｇｒａｐｈｏｆＣａｎｄｉｄａｔｕｓＫｕｅｎｅｎｉｃａｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓｃｏｌｏｎｉｅｓＳｃａｌｎｄｕａｉｂｒｏｄａｅ（Ａ）和ＣａｎｄｉｕｓＳｃａｌｎｄｕａｗａｇｎｅｒｉ（Ｂ）菌落的电子ｄａｔｉ显微镜照片Ｆｉ．　Ｍｉｇ７ｃｒｏｓｃｏｐｉｇｒａｐｈｏｆＣａｎｄｉｄａｔｕｓＳｃａｌｎｄｕａｂｒｏｄａｅｃｉｉｎｄｕａｗａｇｎｅｒｉ（Ｂ）（Ａ）ａｎｄＣａｎｄｉｄａｔｕｓＳｃａｌｃｏｌｏｎｉｅｓ

　第５期郑平，张蕾，：

厌氧氨氧化菌的特性与分类等４７