新方法能力验证确认报告水质 叶绿素a的测定 分光光度法 HJ 897.docx

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新方法能力验证确认报告水质叶绿素a的测定分光光度法HJ897

XXXX有限公司

新项目方法验证能力确认报告

项目名称：

水质叶绿素a的测定分光光度法

HJ897-2017

项目负责人：

项目审核人：

项目批准人：

批准日期：

年月日

水质叶绿素a的测定分光光度法

HJ897-2017

方法验证能力确认报告

1.方法依据及适用范围

本方法依据《水质叶绿素a的测定分光光度法》（HJ897-2017）。

本方法适用于适用于地表水中叶绿素a的测定。

本方法测定丙酮提取液中叶绿素a的检出限为0.04mg/L。

当取样体积为200ml，丙酮提取液体积为10ml时，本方法的检出限为2μg/L，测定下限为8μg/L。

警告：

丙酮对人体健康有一定危害，操作时应在通风橱中进行，佩戴防护器具，避免接触皮肤和衣物。

2.方法原理及干扰

将一定量样品用滤膜过滤截留藻类，研磨破碎藻类细胞，用丙酮溶液提取叶绿素，离心分离后分别于750nm、664nm、647nm和630nm波长处测定提取液吸光度，根据公式计算水中叶绿素a的浓度。

3.主要仪器、设备及试剂

除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为新制备的去离子水或蒸馏水。

3.1试剂和材料

3.1.1丙酮（CH3COCH3）。

3.1.2碳酸镁（MgCO3）。

3.1.3丙酮溶液：

9+1。

在900ml丙酮中加入100ml实验用水。

3.1.4碳酸镁悬浊液。

称取1.0g碳酸镁，加入100ml实验用水，搅拌成悬浊液（使用前充分摇匀）。

3.1.5玻璃纤维滤膜：

直径47mm，孔径为0.45μm～0.7μm。

3.2主要仪器和设备

3.2.1分光光度计，配备10mm比色皿，1台，型号：

XXXX，编号：

XXXXXXXX，检定证书编号：

XXXX，检定有效期限：

XXXX年XX月XX日。

3.2.2采样瓶：

500ml具磨口塞的棕色玻璃瓶。

3.2.3玻璃研钵。

3.2.4离心机，型号：

XXXX，编号：

XXXXXXXX。

3.2.5玻璃刻度离心管：

15ml。

3.2.6针式滤器：

0.45μm聚四氟乙烯有机相针式滤器。

3.2.7一般实验室常用器皿和设备。

4.样品的采集与制备

4.1样品采集

按照GB/T14581、HJ/T91和HJ494中的相关规定进行样品的采集。

样品的采集一般使用有机玻璃采水器或其他适当的采样器采集水面下0.5m样品，湖泊、水库根据需要可进行分层采样或混合采样，采样体积为1L或500ml。

如果样品中含沉降性固体（如泥沙等），应将样品摇匀后倒入2L量筒，避光静置30min，取水面下5cm样品，转移至采样瓶。

在每升样品中加入1ml碳酸镁悬浊液，以防止酸化引起色素溶解。

注：

如果水深不足0.5m，在水深1/2处采集样品，但不得混入水面漂浮物。

4.2样品保存

样品采集后应在0℃～4℃避光保存、运输，24h内运送至检测实验室过滤（若样品24h内不能送达检测实验室，应现场过滤，滤膜避光冷冻运输），样品滤膜于-20℃避光保存，14d内分析完毕。

注：

样品采集后，如条件允许，宜尽快分析完毕。

4.3试样的制备

4.3.1过滤

在过滤装置上装好玻璃纤维滤膜。

根据水体的营养状态确定取样体积，见表1，用量筒量取一定体积的混匀样品，进行过滤，最后用少量蒸馏水冲洗滤器壁。

过滤时负压不超过50kPa，在样品刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镊子将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干滤膜水分。

注：

仅当富营养化水体的样品无法通过玻璃纤维滤膜时，可采用离心法浓缩样品，但转移过程中应保证提取效率，避免叶绿素a的损失及水分对丙酮溶液浓度的影响。

表1参考过滤样品体积

营养状态

富营养

中营养

贫营养

过滤体积（mL）

100～200

500～1000

4.3.2研磨

将样品滤膜放置于研磨装置中，加入3ml～4ml丙酮溶液，研磨至糊状。

补加3ml～4ml丙酮溶液，继续研磨，并重复1～2次，保证充分研磨5min以上。

将完全破碎后的细胞提取液转移至玻璃刻度离心管中，用丙酮溶液冲洗研钵及研磨杵，一并转入离心管中，定容至10ml。

注：

叶绿素对光及酸性物质敏感，实验室光线应尽量微弱，能进行分析操作即可，所有器皿不能用酸浸泡或洗涤。

4.3.3浸泡提取

将离心管中的研磨提取液充分振荡混匀后，用铝箔包好，放置于4℃避光浸泡提取2h以上，不超过24h。

在浸泡过程中要颠倒摇匀2～3次。

4.3.4离心

将离心管放入离心机，以相对离心力1000×g（转速3000r/min～4000r/min）离心10min。

然后用针式滤器过滤上清液得到叶绿素a的丙酮提取液（试样）待测。

4.4空白试样的制备

用实验用水按照与试样的制备相同的步骤进行实验室空白试样的制备。

5.分析步骤

5.1试样测定

将试样移至比色皿中，以丙酮溶液为参比溶液，于波长750nm、664nm、647nm、630nm处测量吸光度。

注：

750nm波长处的吸光度应小于0.005，否则需重新用针式滤器过滤后测定。

5.2空白试验

按照与试样测定（5.1）相同的步骤进行实验室空白试样（4.4）的测定。

6.结果计算与表示

6.1结果计算

试样中叶绿素a的质量浓度（mg/L），按照下式进行计算：

式中：

ρ1——试样中叶绿素a的质量浓度，mg/L；

A664——试样在664nm波长下的吸光度值；

A647——试样在647nm波长下的吸光度值；

A630——试样在630nm波长下的吸光度值；

A750——试样在750nm波长下的吸光度值。

样品中叶绿素a的质量浓度（μg/L），按照下式进行计算：

：

式中：

ρ——样品中叶绿素a的质量浓度，μg/L；

ρ1——试样中叶绿素a的质量浓度，mg/L；

V1——试样的定容体积，ml；

V——取样体积，L。

6.2结果表示

当测定结果小于100μg/L时，保留至整数位；当测定结果大于等于100μg/L时，保留三位有效数字。

7.方法能力验证

7.1检出限

按照样品分析的全部步骤，实验室重复测定7次空白试样。

在仪器最佳稳定状态下测定空白值，统计其标准偏差并计算其检出限，检出限=t（n-1,0.99）×S（其中t（n-1,0.99）=3.143），结果如下表2所示：

表1方法检出限测定数据

空白试样

1

2

3

4

5

6

7

样品浓度（μg/L）

平均值（μg/L）

标准偏差S（μg/L）

检出限MDL（μg/L）

由表1可知，当取样体积为200ml，丙酮提取液体积为10ml时，实验室检出限为x.xxμg/L（测定下限为4倍检出限）小于方法检出限2μg/L（测定下限8μg/L），符合标准方法要求。

注：

方法检出限测定次数最少7次，可以适当增加测定次数，t值取值见HJ168-2010。

7.2精密度和准确度

实验室分别对叶绿素a质量浓度为5μg/L、11μg/L、25μg/L的标准样品（标准样品编号：

XXXXXXXX、XXXXXXXX、XXXXXXXX，有效日期：

XXXXXXXX、XXXXXXXX、XXXXXXXX）进行6次重复测定，结果如表2所示：

表2方法精密度和准确度测定数据

标准样品

测定结果

标准值（μg/L）

5

11

25

样品浓度

（μg/L）

1

2

3

4

5

6

平均值（μg/L）

相对误差RE（%）

标准偏差S（μg/L）

相对标准偏差RSD（%）

由表2可知，本实验室空白加标样品6次测试结果所得的相对误差RE为x.x%～xx%，准确度符合要求；相对标准偏差RSD为x.x%～xx%，精密度符合标准方法要求。

实验室实验室分别对叶绿素a质量浓度为11μg/L、25μg/L的标准样品（标准样品编号：

XXXXXXXX、XXXXXXXX，有效日期：

XXXXXXXX、XXXXXXXX、）进行加标回收测定，测定结果如表3所示：

表3实验室加标回收测定数据

标准样品

测定结果

标准值（μg/L）

11

25

加标量（μg/L）

9

28

样品浓度

（μg/L）

1

2

3

4

5

6

平均值（μg/L）

加标回收率（%）

由表3可知，本实验室加标回收测定结果为x.x%和x.x%，符合方法标准要求。

8.监测实例

本单位实验室两组人员分别对某河道地表水进行采样监测，同时进行实际样品加标测定，标准品浓度值为xx±xμg/L，标准品编号为：

XXXXXXXX，有效期限：

XXXX年XX月XX日，加标浓度为XXμg/L（浓度接近实际样品浓度）。

测定结果如下表4和表7所示：

表4：

监测实际样品及加标回收测定数据

实际样品测定结果

人员1

人员2

实验室空白

实际

样品

加标

样品

实际

样品

加标

样品

样品浓度（μg/L）

相对误差（%）

/

实际加标回收率（%）

/

注：

实验室空白结果须小于方法检出限。

由表4可知，本实验室两组人员测定结果相对误差为XX%，符合实验室人员比对分析质量控制要求；实际样品加标回收率分别为x.x%和x.x%，符合方法标准要求。

9.结论

通过验证，依据本方法依据《水质叶绿素a的测定分光光度法》（HJ897-2017）对地表水中叶绿素a的监测，本实验室设备、人员能力、方法的检出限、精密度、准确度等均满足标准方法要求。