土壤微生物生物量的测定.docx

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土壤微生物生物量的测定

《土壤微生物生物量的测定-底物诱导呼吸法》编制说明

（征求意见稿）

《土壤微生物生物量的测定-底物诱导呼吸法》编制组

二0一二年十二月一日

目录

1、项目背景1

2、标准制修定的必要性分析1

2.1土壤微生物生物量的研究意义重大1

2.2土壤质量标准化与土壤科研工作的需要2

3、土壤微生物生物量研究方法的历史3

4、标准编制的原则4

5、标准制定的目标、主要技术内容及说明5

5.1方法研究的目标5

5.2适用范围5

5.3术语和定义5

5.4原理6

5.5测量条件6

5.6试剂与材料6

5.7分析步骤6

5.8结果计算6

6、对实施本标准的建议7

7、参考文献7

1、项目背景

为了更好地监测土壤的质量和保护土壤环境，根据国家质量监督检验检疫总局国家标准化管理委员会文件国标委综合【2011】82号《关于下达2011年第三批国家标准制修订计划的通知》，《土壤微生物生物量的测定-底物诱导呼吸法》顺利立项。

本标准由中国科学院亚热带农业生态研究所和中国科学院南京土壤研究所共同承担，计划编号201111824-T-326。

2012年5月，中国科学院亚热带农业生态研究所接到转化《Soilquality-Determinationofsoilmicrobialbiomass-Part1Substrateinducedrespirationmethod》（ISO142402-1:

1997）的任务后，立即成立了标准编制组，小组成员包括多年从事土壤微生物分析研究和熟悉国家标准编制的专家。

土壤微生物生物量是土壤有机质最活跃和最易变化的部分，而且与土壤碳、氮、磷、硫等养分的循环密切相关，可直接或间接反映土壤肥力和土壤环境质量的变化。

目前土壤微生物生物量测定应用较为广泛的方法有底物诱导呼吸法、熏蒸提取法等，但未制定国家标准。

因此，土壤微生物生物量测定标准的编制，可以规范土壤微生物生物量的测定方法和扩大其应用范围，有利于人们更好地了解土壤-微生物-植物-环境相互作用。

2、标准制修定的必要性分析

2.1土壤微生物生物量的研究意义重大

土壤微生物生物量（soilmicrobialbiomass）是指生物体积小于5×103μm3活的微生物总量，但不包括活的植物体，如植物根系等（吴金水等，2006；李振高等，2008）。

广义的土壤微生物量应包括微生物碳、氮、磷、硫。

众所周知，土壤微生物是土壤有机质和土壤养分（C,N,P,S等）转化和循环的驱动力，它参与有机质的分解、腐殖质的形成、养分的转化和循环的各个生化过程（林先贵，2010）。

土壤微生物生物量虽然只占土壤有机质的3%左右，但其作为土壤养分的储存库和植物生长可利用养分的重要来源，与微生物个体数量指标相比，更能反映微生物在土壤中的实际含量和作用潜力。

据估计植物吸收N、P、S的60%，47%和28%分别来自微生物量N、P和S。

而且，微生物是土壤中活的生命体，对土壤各种环境因子的变化极为敏感，因而微生物量的变化常被作为土壤肥力、土壤环境污染、其他各种扰动对土壤健康影响的灵敏性指标。

因此，了解土壤微生物生物量有助于更好地理解影响土壤健康的主要因素，亦对制定良好措施来提高土壤质量有重要意义。

2.2土壤质量标准化与土壤科研工作的需要

土壤微生物量是植物有效养分的储备库和源，其对土壤碳、氮、磷和硫的植物有效性及在陆地生态系统的循环具有重要的影响。

土壤微生物生物量库的长期或是季节性变化都可作为土壤质量的可靠的指示，对于了解土壤养分的动态变化具有重要的作用。

土壤微生物生物量是一种可快速测定和重复性好的参数，也可以用于对土壤的粗略比较以及反映土壤管理的改变和污染的影响。

土壤微生物生物量的定量分析是了解微生物对土壤有机质与养分循环和转化作用的重要方法。

土壤微生物生物量的测定方法既有传统方法，也有现代方法。

在20世纪初发展起来的微生物计数方法至今仍在应用。

同时随着土壤生物学和生物化学的不断发展，新的方法也层出不穷。

在土壤微生物生物量测定方法中，底物诱导呼吸法是Anderson&Domsch（1978）首先提出的，根据添加的易分解底物在培养初期的分解速率来估计土壤微生物生物量。

该方法操作简单，耗费低，准确度较高，是土壤微生物生物量分析中的经典方法。

该方法已形成了国际标准，为了扩大土壤微生物生物量的测定方法的应用范围，以及在土壤科学的科研工作中测定土壤微生物生物量指标时形成准确的、统一、可比较的数据，制定《土壤微生物生物量-底物诱导呼吸法》的国家标准十分必要。

2.3国家及土壤质量主管部门的要求

目前，我国越来越重视标准化工作，国家标准制定的工作任务中要求形成我国自有知识产权的适合我国土壤质量监测与分析的相关标准。

借此机遇，土壤科研领域的专家成立了“全国土壤质量标准化技术委员会”，以期大力发展土壤质量标准化工作，逐渐构建我国土壤质量标准化体系。

根据国家质量监督检验检疫总局国家标准化管理委员会文件国标委综合【2011】82号《关于下达2011年第三批国家标准制修订计划的通知》的要求，全国土壤质量标准化委员会有15个土壤质量国家标准通过国家标准委的审批并立项，“土壤微生物生物量-底物诱导呼吸法”即为其中的一个项目。

根据国家标准制定工作的任务及土壤质量国家标准制定的需要，完成该标准的制/修订，对于指导我国土壤质量监测与监管有重要意义。

3、土壤微生物生物量研究方法的历史

早在20世纪70年代，土壤微生物学研究者采用土壤微生物细胞培养计数法，从土壤中提取和计数微生物的数量，但此种方法仅能获得土壤中极少部分微生物，且不能得到有关这部分微生物活性方面的信息，远不能满足对土壤微生物特征的描述及研究其对土壤的重要作用。

由于传统的土壤微生物细胞培养计数法，提取和培养方法存在的不足，使得到的结果重复性较差，甚至相差3个数量级。

尽管如此，培养计数法在很长时期内仍然是微生物学家了解土壤微生物数量的基本方法。

培养计数法的优点是适合于对某些特殊土壤微生物的研究，但在使用该方法时应反复检查其适应性。

到1976年Jenkinson和Powlson提出间接法测定微生物生物量后，土壤微生物生物量库在生态学和微生物学上才得到重视。

该方法是基于氯仿熏蒸将土样中微生物细胞杀死和溶解，再用土壤接种，测定培养10天内土样的呼吸，与未熏蒸对照土样比较，由于熏蒸土样微生物被杀死和微生物生物碳的分解，从而使释放的CO2增加。

该方法称为熏蒸－培养法（FI）。

与此同时还提出采用FI法测定土壤微生物生物量氮。

Anderson等在1978年提出了测定微生物生物量的另一生理学方法，即所谓的底物诱导呼吸法（Substrate-inducedrespiration，SIR）。

该方法主要基于微生物在纯培养时对易利用底物（如葡萄糖）供应在呼吸作用上有直接的响应，由此推断易利用底物引起的呼吸量变化与土壤微生物生物量碳呈线性关系。

FI和SIR法都有其不足之处。

FI法需较长时间（10天），且不适合酸性土壤。

SIR法是采用FI法校准，不同的校正系数使采用SIR测定的数据计算得到的微生物生物量碳常常会产生争议，此外SIR法不适合添加了新鲜有机底物的土壤。

Anderson和Domsch于1975年提出采用选择性抑制技术分别测定土壤细菌和真菌生物量，通过添加特异性抗生素能抑制土壤中的细菌或真菌的生长，从而可测定计算得到真菌与细菌的比率。

West等1987年提出了通过测定土壤麦角甾醇含量估计土壤真菌生物量，因为麦角甾醇是大多数子囊菌、担子菌和半知菌类中主要的甾醇，可作为真菌生物量的指示。

但目前还发现没有一个通用的转换系数将麦角甾醇含量转换为真菌生物量，该方法测定真菌生物量引起科研人员的质疑，指出麦角甾醇含量只能反映土壤真菌细胞膜量。

尽管如此，麦角甾醇含量仍然能在一定程度上估算土壤中真菌群落生物量。

至今仍用于土壤真菌生物量的测定。

1976年，Jenkinson和Powlson等最先提出了土壤微生生物量碳的熏蒸培养法，为土壤微生物生物量的测定找到一种较为方便的间接方法。

但该方法对熏蒸灭菌、熏蒸后去除氯仿及培养装置的密封性、培养条件和时间需要严格的要求，而且培养时间较长，不适宜样品的大量分析。

Brookes等在1982和1985年分别提出了更直接的估算土壤微生物生物量磷和氮的方法。

经氯仿熏蒸的土样直接提取（即熏蒸－提取法，Fumigation-extration，FE）后测定土壤微生物生物量磷和氮。

1981年Sagger等采用FE法测定土壤微生物生物量硫。

1987年Vance等在FE法的基础上，建立了氯仿熏蒸提取-容量分析法测定土壤微生物生物量碳。

之后，Wu等（1990,1993）对FE法测定土壤微生物生物量的方法进行了改进，又建立了氯仿熏蒸提取-仪器分析法，该方法更为快速、简便、精确，适于大量样品的分析。

SIR和FE法已成为测定土壤微生物生物量最常用的2种方法，目前这2种方法已被一些国家（如德国）权威机构认定为土壤常规监测方法，形成了国际标准（ISO142402-1:

1997:

E和ISO142402-2:

1997:

E）。

国内在土壤科学研究中，根据其目的的不同也多采用SIR和FE法对土壤微生物生物量进行测定分析，但还尚未形成国家标准。

4、标准编制的原则

（1）本标准的编写依据《标准化工作导则第1部分：

标准的结构和编写》和《标准化工作指南第2部分：

采用国际标准》

（2）本标准的制定与国际标准《Soilquality-determinationofsoilmicrobialbiomass-Part1substrateinducedrespirationmethod》（ISO142402-1:

1997:

E）的一致性为等同的原则

（3）本标准方法准确可靠，能满足土壤科学研究与土壤质量监测分析测试的要求

（4）本标准方法具有普遍适用性，操作简单，耗费低，易于推广应用。

5、标准制定的目标、主要技术内容及说明

本标准的主要内容包括：

术语和定义、原理、测量条件、试剂与材料、仪器、程序、及结果计算等。

5.1方法研究的目标

（1）确定方法的适用范围

（2）转化ISO142402-1:

1997方法，形成标准文本

（3）通过实验和验证，确定方法的可行性和适用性

5.2适用范围

等同转化ISO142402-1:

1997标准规定土壤微生物生物量-底物诱导呼吸法的测定方法。

等同转化ISO142402-1:

1997标准适用于通气良好的农业土壤及矿质土壤中好气型异养微生物生物量的测定，但不可用于土壤化学物质对生物量影响的测定。

5.3术语和定义

土壤微生物生物量

土壤中所有微生物细胞的生物量。

这一指标可通过计算这些细胞中碳或氮的含量来测定，或者通过它们矿化外加碳源的能力计算。

在用碳或氮含量分析时可能包括死细胞或者细胞碎片，但用呼吸法时，测量的是活细胞生物量。

土壤呼吸速率

一定温度条件下，单位时间单位质量土壤释放出的CO2量。

5.4原理

本标准通过向土壤加入葡萄糖，形成系列葡萄糖含量梯度，直到达到最高呼吸速率（一般不超过1小时）。

这一呼吸速率作为最大初始呼吸速率，可用于估算土壤活性生物量。

5.5测量条件

本标准生物量的测定需要在恒温（22±1℃）恒湿环境中进行。

土壤样品含水量要求与原状土一致。

需要注意的是，土壤呼吸速率到生物量的转化系数，其计算的温度条件是22±1℃。

5.6试剂与材料

土壤样品

土壤采样，处理及贮存参考ISO10381-6进行。

土壤样品的分析等效转化ISO142402-1:

1997的方法。

材料

粉末状D-葡萄糖，细石英（颗粒直径为0.1-0.5mm）或者滑石粉。

仪器

除常用实验室仪器设备，还需要以下仪器：

陶瓷研钵、搅拌机、全自动红外气体分析仪或气相色谱