胡萝卜愈伤组织的诱导培养.docx
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胡萝卜愈伤组织的诱导培养
实验序号
01
实验名称
胡萝卜愈伤组织的诱导培养
实验时间
2010年4月——5月
实验室
组培实验室
1．实验目的
1）、通过本次实验，能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂。
2）、通过本次实验，使学生能熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。
3）、通过本实验，使同学们能够熟练的掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，同时能设计和配制胡萝卜愈伤组织增殖培养基。
4）、通过本次实验，使同学们熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。
2．实验原理、实验流程或装置示意图
1）、培养基的成分
目前，不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。
2）、培养基的配制方法
Ⅰ、配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉溶解在蒸馏水里，加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，再加入蒸馏水使之达到最终的容积。
最后调节PH值，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。
Ⅱ、如果没有培养基干粉，则可采用以下两种方法来配制：
①一个是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起。
②另一个是先配制一系列的浓缩贮备液（母液），贮存在2~4℃冰箱内，待配培养基时取出，按比例稀释配用。
此法较为常用。
3）、MS培养基母液的配制
在配制MS培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。
通常把每种试剂单独溶解后再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。
混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42-和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物；同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。
母液的配制有两种方法：
ⅰ一种是配制成单一化合物母液。
此法适合配制多种培养基都需要的同一种母液。
ⅱ另一种是配成几种不同化合物的混合母液。
此法在大量配制同种培养基时省力。
配好的母液应放在试剂瓶中贮存。
3．实验设备及材料
1）、设备：
冰箱、普通天平、分子天平、试剂瓶（棕色和白色）、量筒、烧杯、容量瓶、搪瓷杯、药勺、称量纸、玻棒、标签纸、三角瓶、吸管、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（５.４～７.０）、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、50ml三角瓶、1000ml搪瓷杯、50ml量筒、10ml和5ml吸管、PH试纸（5.4～7.0）
2）、药品和试剂：
硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2、4—D（2、4—二氯苯乙酸）、6—苄基腺嘌呤（6—BA）、盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水等。
蒸馏水、琼脂、蔗糖、生长调节物、盐酸（1mol·L-1）、氢氧化钠（1mol·L-1）。
胡萝卜愈伤组织诱导培养基、无菌水、75%酒精、0.1%氯化汞、MS基本培养基和常用试剂母液、蒸馏水。
3）、实验材料：
胡萝卜储藏根
4．实验方法步骤及注意事项
一）、MS基本培养基母液和常用试剂的配制
母液的配制方法：
1）、配制成单一化合物母液。
此法适合配制多种培养基都需要的同一母液。
2）、配成几种不同的化合物的混合母液。
此法适用在大量配制同种培养基时省时省力。
配好的母液应放在试剂瓶中储存。
在配制MS培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的顺序，以免发生沉淀。
通常把每种试剂单独溶解后再与别的已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。
混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42+和PO43—错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物。
同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。
1）、大量元素母液的配制
MS培养基中的大量元素除C、H、O外，剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应，它们可配在同一母液中。
配制的步骤为：
称量分别溶解装瓶贴标签放入冰箱保存。
注意：
CaCl2·2H2O最后加入。
母液成分
成分
规定用量/mg·L—1
扩大倍数
母液定容体积/L
称取量/mg
配1LMS培养基吸取量/ml
大量元素
KNO3
1900
20
0.5
19000
50
NH4NO3
1650
16500
CaCl2·2H2O
440
4400
MgSO4·7H2O
370
3700
KH2PO
170
1700
2）、微量元素母液的配制
MS培养基中的微量元素可由MnSO44H2O、ZnSO47H2O、H3BO3、KI、NaMoO42H2OCuSO45H2O、CoCl26H2O几种无机盐来供应，它们也可配在同一母液中。
配制步骤同大量元素。
（具体配制如下表）
母液种类
成分
规定用量/mg·L—1
扩大倍数
母液定容体积/L
称取量/mg
配1LMS培养基吸取量/ml
微量元素
MnSO44H2O
22.3
200
1
4460
5
ZnSO47H2O
8.6
1720
H3BO3
6.2
1240
KI
0.83
166
NaMoO42H2O
0.25
50
CuSO45H2O
0.025
5
CoCl26H2O
0.025
5
3）、有机成分母液的配制
MS培养基中所需的维生素和氨基酸等有机成分母液应分别单独配制，配制步骤同上（具体配制见下表）
母液种类
成分
规定用量/mg·L—1
扩大倍数
母液定容体积/L
称取量/mg
配1LMS培养基吸取量/ml
有机成分
甘氨酸
2.0
200
0.1
40
5
盐酸硫胺素
0.1
2
盐酸吡哆素
0.5
10
烟酸
0.5
10
肌醇
100
2000
4）、铁盐母液的配制
铁盐母液宜单独配制，其配法如下：
称取1390mg硫酸亚铁和1865mg乙二胺四乙酸二钠分别蓉于蒸馏水中，将二者混合后煮沸数分钟，调节pH值至5.8左右，定容至250ml,装入试剂瓶中备用。
用时每配1L培养基取该液5ml。
（具体配制见下表）
母液种类
成分
规定用量/mg·L—1
扩大倍数
母液定容体积/L
称取量/mg
配1LMS培养基吸取量/ml
铁盐
Na2EDTA
37.3
200
0.25
1865
5
FeSO4·7H2O
27.8
1390
5）、植物生长调节物质母液的配制
对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg·ml－1ppm（即百万分之的浓度，指一百万份重量的溶液中，所含溶质的份数）较为方便，一般配制成0.5mg·ml－1母液，这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶。
母液种类
成分
称量/mg
母液定容体积
母液浓度/ppm
生长调节物质
2,4—D/NAA
50
100
赤霉素
10
6—BA
10
6）、其它常用试剂的配制
盐酸（1mol·L-1）氢氧化钠（1mol·L-1）
酒精（75%）用95%的酒精或无水酒精来配制
配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、配制日期、配制者。
母液最好在2～4℃的冰箱中保存。
尤其对生长调节物质与有机类物质要求较严。
储存时间不宜过长，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用。
二）、胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制：
1）、药品及用具的准备
Ⅰ、MS培养基母液的准备
配制培养基时先将事先配制储存的母液按顺序放好，并检查这些母液是否已经变色或产生沉淀或结晶，已失效的就不能取用。
包括大量元素、微量元素、铁盐、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇。
Ⅱ、用具、用品的准备
将洁净的各种用具如三角瓶、量筒、烧杯、吸管、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（５.４～７.０）、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅、蒸馏水、琼脂、蔗糖、生长调节物、盐酸（1mol·L-1）、氢氧化钠（1mol·L-1）
2）、培养基配制的步骤
（1）、根据需要配制培养基的量（各小组500ml）称好所需的琼脂放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水置于电炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅拌。
（2）、待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放在一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需的生长调节物质，定容至所需的体积，并用玻棒搅拌均匀。
（3）、调节培养基的酸碱性至PH5.8。
由于培养基的PH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大的影响。
此外，PH还影响到琼脂培养基的凝固情况。
所以，当培养基配制好后应立即进行PH值的调整。
培养基若偏酸时用氢氧化钠（1mol·L-1）来调节，若过碱就用盐酸（1mol·L-1）来调整。
（4）、配制好的培养基要趁热分装，试管、三角瓶等培养基的容器加注量应占容积的1/3~1/4。
（5）、培养基的灭菌消毒
灭菌时，压力表读数为0.11MPa,温度121℃时保持30分钟左右即可。
为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压之前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。
排净冷空气的方法：
可事先打开放气阀，煮沸等大量热蒸汽排出后再关闭；也可采用先关闭放气阀，待压力升到一定时打开放气阀排出空气，再关闭放气阀。
培养基消毒灭菌的时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围;否则，培养基中的蔗糖、有机物质、特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。
当灭菌完成后，应切断电源或热源，当灭菌锅内压力降到“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。
切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员。
3）、无菌蒸馏水和接种工具准备
在250ml培养瓶中加入100ml蒸馏水，封口包扎；分别取抢状镊子2把、眼科手术剪和手术刀1把，用牛刀纸和橡皮圈包扎成一套；每套培养皿内放入合适滤纸2～3张，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；然后和培养基一起统一灭菌。
三）、胡萝卜愈伤组织的诱导：
1）、准备工作
（1）、接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；消毒溶液、无菌水、装材料的容器、剪刀、镊子、培养皿、计时器、待用培养基等的准备。
（2）、实验材料的准备
第一步：
材料的修整、刷洗、冲洗。
第二步：
是用洗衣粉水或肥皂水浸洗并搅动。
2）、植物材料表面的灭菌
A、工作人员吸收消毒
B、装材料的容器及玻璃棒用酒精进行表面消毒
C、将待消毒材料浸入75%酒精中10秒，取出用无菌水冲洗
D、倒入消毒液并计时
E、到时倒出消毒液
F、倒入无菌水清洗后，切块接种到培养基上
3）、胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制：
配方：
MS基本培养基+1.0mg·L—12，4—D+0.1mg·L—16—BA+200mg·L—1水解蛋白+3%蔗糖+0.7%琼脂粉
配制流程：
（同胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制）
四）、胡萝卜愈伤组织的增殖（继代培养）
1）、准备工作
接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；剪刀、镊子、已经灭菌的培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；材料的准备（选择装有无污染的已经分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放在干净工作台上）
2）、愈伤组织的继代培养
将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体上产生的愈伤组织剥离转移接到愈伤组织继代培养基上，放置于25℃全黑的暗条件下进行愈伤组织的增殖培养，已获得足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。
3）、胡萝卜细胞悬浮培养培养基的配制
（1）配方：
MS基本培养基+2.0mg/LNAA+0.1mg/L6—BA+200mg/L水解酪蛋白+3%蔗糖
（2）配制流程：
（同胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制）
五）、注意事项：
1、所有的组织培养实验操作都必须在无菌条件下进行，所以我们必须时时注意实验材料的无菌和消毒，实验用具必须经过严格的灭菌，在灭菌的时候要特别注意必需等到烧热的实验仪器冷却后在接触材料，否则会把材料“烫伤”，所有的转移材料的操作必需在无菌操作台上进行。
2、培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。
当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。
切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员。
3、配制培养基时，要按照规定的用量认真计算并严格取出相应的母液来进行配制，配制玩培养液后要调定其PH值在规定范围。
需要加琼脂的培养基在溶解琼脂时一定要充分煮沸，使培养液中看不到任何悬浮物完全透明为止。
培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用细绳以统一标准的方法扎紧瓶口，放入灭菌锅内灭菌。
参考文献
1、李浚明、朱登云编译植物组织培养教程第三版中国农业大学出版社2005年9月
2、尹文兵、李丽娟等胡萝卜愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养研究山西师范大学学报2004年第18卷第02期
3、王连清主编植物组织培养北京中国农业出版社2002
4、王玉英MS培养基的配制方法《生命世界》1983年05期
5.实验结果
⑴胡萝卜愈伤组织的诱导结果：
经过诱导，有2瓶成功诱导出了愈伤组织，而另外2瓶则被污染。
上图中前2瓶愈伤组织的长势非常好，所有的材料都产生了愈伤组织，诱导出的愈伤组织不但体积非常大，而且结构疏松，呈现淡黄色。
后2瓶，则因为被污染，所有的材料均未产生愈伤组织，并且瓶内呈现黑色。
⑵继代培养的结果：
如上图所示，继代培养得到的三瓶均无污染，三瓶中的愈伤组织增殖情况均良好，其中2瓶特别好，愈伤组织呈现结构疏松的特点。
4.2．对实验现象、实验结果的分析及其结论
诱导得到的2瓶愈伤组织，从实验照片可以看出2瓶培养瓶中所有的材料都产生了愈伤组织，诱导出的愈伤组织不但体积非常大，而且结构疏松，呈现淡黄色。
而另外2瓶则受到了污染，从理论上讲在整个操作过程中，对4瓶的操作几乎完全一样，但却得到了不同的结果。
观察被污染的2瓶，究其原因可能是操作中由于某种未知原因引入了细菌。
继代培养后得到的3瓶增殖情况均良好，长满了整个培养瓶，做细胞悬浮培养的时候轻轻一压就得到了单个的碎片，证明愈伤组织的结构很疏松。
3．实验总结
本次实验过程主要包括MS基本培养基母液和常用试剂的配制、胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制、胡萝卜愈伤组织的诱导、胡萝卜愈伤组织的增殖四个阶段，实验的关键是操作过程中不能引入杂菌污染。
在配制MS基本培养基母液和常用试剂时，先要经过计算得出溶剂的体积，在老师的讲解下，我学会了各种母液和试剂的配制。
尤其是试验中的细节：
在大量元素母液的配制过程中药品CaCl要在最后加入，避免它与其它物质反应生成沉淀。
在诱导产生愈伤组织的过程中，最关键的就是不能引入杂菌以及防止烫坏材料，为了确保实验成功，我在操作过程中，严格按照无菌操作的要求，保持胆大心细和耐心等待的态度，不放过每一个细节，最终得到了非常好的愈伤组织。
这就为后面的继代培养奠定了基础。
在继代培养操作中，由于前面得到了很好的愈伤组织，所以得到了很好的继代培养材料，最终继代培养的结果也非常好。
在整个实验过程中，我有2次“守锅”经历，这也使得我完全掌握了高压灭菌锅的使用方法。
还有老师那严谨的实验态度和执教风格也给了我一些启迪。
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