组织培养.docx

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组织培养

组培的基本操作

1、培养基的主要成分

1水分：

构成培养基的绝大部分组分为水分。

在研究上，常用蒸馏水来配制培养基，而最为理想的水应该是纯水。

2无机盐类：

无机盐类中根据植物的需要量可以分为大量元素和微量元素。

植物从培养基中吸收的大量元素有N、P、K等。

它们是构成植物细胞中核酸、蛋白质以及生物膜系统等必不可少的营养元素。

微量元素包括Fe、Mn、Zn、B等，它们在培养基中的添加量虽然很少，但也是不可缺少的，这些元素是很多酶和辅酶的重要成分，直接影响着蛋白质的活性，铁又是叶绿素的重要成分。

3有机营养成分

、糖类物质：

对于植物组织培养中幼小的外植体而言，由于其光合作用的能力较弱，培养基中的糖类物质就成了其生命活动中必不可少的碳源和能源。

除此之外，糖类的添加还有调节培养基渗透压的作用

、维生素类：

维生素类物质的添加对愈伤组织和器官形成有促进效果。

维生素C还有防止组织褐变的作用

、氨基酸类：

在培养基中常用的氨基酸有甘氨酸、酪氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、天门冬胺等。

这些氨基酸类物质不仅为培养物提供有机氮源，同时也对外植体的生长以及不定芽、不定胚的分化促进作用。

④植物生长调节物质：

植物生长调节剂在培养基中的用量虽然微小，但是其作用很大。

它不仅可以促进植物组织的脱分化和形成愈伤组织，还可以诱导不定芽、不定胚的形成，最常用的有生长素和细胞分裂素，有时也会用到赤霉素和脱落酸。

⑤天然物质； 椰子汁、香蕉泥等天然有机物质的添加，有时会有良好的效果，在这些天然有机物质中，通常含有机营养成分或生理活性物质。

⑥PH；pH过高时，培养基会变硬；pH过低时，则影响培养基的凝固

⑦凝固剂：

在配制固体培养基时，需要使用凝固剂。

最常用的凝固剂是琼脂

其他添加物：

有时为了减少外植体的褐变，需要向培养基中加入一些防止褐化的物质，如活性碳、维生素C等。

此外，在灭菌比较困难的植物材料时，也可以添加一些抗生素物质，以此来抑制杂菌生长。

2、培养基的基本类型

含盐量较高的培养基：

其代表是MS培养基，主要特点是无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾离子和铵离子含量丰富，元素平衡较好，缓冲性能好，微量元素和有机成分含量齐全且丰富，是目前使用最广泛的培养基。

硝酸钾含量较高的培养基：

有B5培养基、N6培养基等，其特点是培养基的盐类浓度较高，铵态氮含量较低，但盐酸硫胺素和硝酸钾含量较高

中等无机盐含量的培养基：

有Nitsch培养基等。

这类培养基的共同特点是大量元素的含量约为MS培养基的一半，微量元素种类少含量高，维生素种类多。

低无机盐含量的培养基：

有White培养基等。

此类培养基的共同特点是无机盐含量非常低，为MS培养基的1/4左右，有机成分也很低。

3、MS、B5、N6、white培养基的特点

①MS培养基的无机盐类浓度较高，尤其是铵盐和硝酸盐含量高，能够满足快速增长的组织对营养元素的要求，是一种应用广泛的培养基。

但它不适合生长缓慢、对无机盐类浓度要求比较低的植物，尤其是不适合铵盐过高易发毒害的植物。

②B5培养基铵的含量比较低，在豆科植物上用得较多，也适用于木本植物

③N6培养基是在水稻、小麦以及其他植物的花粉和花药培养中被使用。

其KNO3和（NH4）2SO4含量较高，但不含元素钼。

④White培养基是一种无机盐类浓度较低的培养基，pH为5.6，在一般植物组织培养中用途也比较广泛，同时，它还非常适合于生根培养和幼胚的培养。

4、培养基的配制的具体步骤：

①取出母液并按顺序放好，并将有机营养物质贮存液溶化待用。

将洁净的各种玻璃器皿如量筒、烧杯、移液管、移液枪和玻璃棒等放在指定位置；

②取一只烧杯，放入1/3左右（配制培养基总量的1/3左右）纯水，将母液按顺序加入，并不断搅拌；

③加入植物生长调节剂和蔗糖，待糖溶解后定容；

④将定容的培养基倒入容器中，加入琼脂，并加热使其完全溶解；

⑤调整pH,用预先配好的氢氧化钠或稀盐酸进行调整；

⑥将培养基分装倒培养器皿中，封好瓶口；

⑦灭菌，用高压锅灭菌（121℃，15～20min）或过滤除菌；

⑧灭菌后待高压锅温度下降到50℃以下时，便可以取出、冷却凝固后待用。

5、外植体的选择原则

①再生能力强

②遗传稳定性好

③外植体来源丰富

④外植体灭菌容易

植物组织培养的基本原理

1、愈伤组织是如何形成与成长的

（1）愈伤组织的形成

A、诱导期

又称启动期，是愈伤组织形成的起点，是指细胞准备进行分裂的时期。

当外植体上已分化的活细胞在外源激素和其他刺激因素的作用下，细胞的大小虽变化不大，但其内部却发生了生理生化变化，如合成代谢加强、迅速进行蛋白质和核酸的合成

B、分裂期

此时，外植体的外层细胞出现了分裂，中间细胞常不分裂，故形成一个小芯。

由于外层细胞迅速分裂使得这些细胞的体积缩小并逐渐恢复到分生组织状态，细胞进行脱分化。

处于分裂期的愈伤组织的共同特征是：

细胞分裂快，结构疏松，缺少又组织的结构，颜色浅而透明。

如果在原培养基上培养，细胞将不可避免地发生分化，产生新的结构，而将其及时转移到新鲜培养基上，愈伤组织可无限制地进行细胞分裂，维持其不分化的状态。

C、分化期

停止分裂的细胞发生生理代谢变化而形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织，在细胞分裂末期，细胞内开始发生一系列形态和生理变化，导致细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞

（2）愈伤组织的生长

愈伤组织的生长过程中会发生以下生理生化变化：

A、在诱导期和分裂始期，每个分裂细胞中的RNA含量迅速增加，并达到一个高峰，但在继续分裂过程中，RNA的含量减少。

B、同工酶谱发生变化，如菜豆的谷氨酸脱氢酶谱带在继代培养后，由原来的5条变为单带，到培养末期才逐渐恢复到5条。

C、连续继代培养可能改变次生物质的积累水平和能力，但培养物无法积累特殊物质并不意味着生化合成能力的丧失，仅仅说明在培养条件下这种能力无法表现，这是由于在继代培养过程中有关酶的破坏所致。

D、延长培养期可能使愈伤组织对生长素的需求发生变化，导致生长素的自给或自养，出现驯化现象

2、植物离体培养中再生植株有哪些途径？

（1）器官发生

A、器官型:

直接从外植体的细胞形成器官原基,继而发育成器官。

B、器官发生型：

从外植体先行成愈伤组织,再由愈伤组织产生不同的器官原基。

在离体培养中,通过根芽发生而形成再生植株的方式大致有三种:

a在芽产生之后,在芽形成的茎的基部长根而形成小植株；

b先形成根,再在根上长出芽来；

c在愈伤组织不同部位分别形成根和芽,然后再形成维管组织把两者连接起来形成植株

（2）胚胎发生

A直接途径：

从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎

B间接途径:

外植体先脱分化形成愈伤组织，再从愈伤组织的某些细胞，即重新“决定”为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎

3、植物体细胞胚胎发生过程中有哪些生理生化变化

①蛋白质：

合成活跃，含量和种类增加

②核酸：

合成速率增加

③多胺代谢：

多胺含量升高

④糖类：

淀粉升高

⑤生长素：

早期含量较高，发育后期含量下降

⑥赤霉素：

赤霉素水平呈下降趋势

⑦活性氧：

活性氧水平提高

4、影响植物离体形态发生的因素

①植物种类和基因型

②培养材料的生理状态

A植株的发育年龄:

幼态组织比老态组织有较高的形态发生能力

B培养器官或组织类型：

同一植株不同器官，同一器官不同部位，外植体大小，不同季节来源

C培养时间和细胞倍性：

培养时间过长会降低形态发生的能力

③培养基

A植物营养：

碳水化合物，铵态氮

B植物生长调节剂：

生长素，GA，细胞分裂素，乙烯，脱落酸

C物理性质：

固态还是液态，渗透压，PH

④培养条件

A光：

光强、光长、光质

B温度

植物器官和组织培养

1、植物器官和组织培养的基本程序

①无菌外植体的获得

A茎尖、茎段、叶片的灭菌：

茸毛多的外植体用皂液洗涤再用清水冲洗

B根、块茎、鳞茎的灭菌：

对凹凸不平及鳞片缝隙处用软刷清洗

C花蕾的灭菌：

采摘后直接灭菌

D果实和种子的灭菌，表皮有蜡质，在灭菌剂中加入几滴吐温-80

②初代培养物的建立

通过灭菌后，要建立初代无菌培养材料，并使其增殖和发育，要有无菌环境，操作要规范，且条件适宜

③形态发生和植株再生

4培养产物的观察记载

愈伤组织胚状体芽根

植物胚胎培养及离体授粉

1、胚培养的应用

1克服远缘杂交不亲和性：

远缘杂交中胚发育不良，胚乳发育不良以及幼胚的早期败育，可以将幼胚进行离体培养，产生远缘杂种

2打破种子休眠，缩短育种周期：

通过幼胚培养，可促使植物的幼胚达到生理和形态上的成熟而提早萌发，形成植株

3提早种子萌发率：

胚培养可以促进生活力低的种子萌发和形成幼苗

2、离体授粉的意义主要表现在那些方面

①克服受精前障碍：

受精前障碍是指花柱太长或花粉管生长缓慢，花粉管在花柱中破裂，使受精作用不能正常进行，可以采用消除柱头和花柱的障碍，让花粉直接与胚珠接触，从而实现受精并使种子得到发育和成熟，可以通过离体柱头授粉，离体子房授粉和离体胚珠授粉，克服远缘杂交不亲和性，

②克服受精后障碍：

受精后障碍受精虽然能正常进行，但是由于胚和胚乳之间的不亲和性，或胚乳发育不良，杂种不能发育成熟，可以采用胚培养或子房培养或胚珠培养来克服

3、胚乳培养的应用

①通过胚乳培养可以直接生产大量的三倍体植株，解决三倍体材料的来源问题，满足生产需要，产生无子果实和花朵大的花卉。

②胚乳细胞以淀粉、蛋白质和脂类的形式贮存着大量的营养物质，所以胚乳培养为研究这些产物的生物合成及其代谢提供了一个很好的实验系统。

植物花粉和花药培养

1、花粉和花药培养的应用

①作物育种：

利用F1代杂交种的花药和花粉培养可以获得单倍体，并经染色体加倍，可缩短育种周期，增加重组型的选择几率。

②物种进化研究：

利用单倍体育种可以查明亲本染色体组的构成

③遗传分析：

单倍体是研究基因性质及其作用的良好材料

④分子生物学：

建立RAPD连锁图，需要建立合适的作图群体

⑤植物基因克隆筛选：

由于单倍体可直接表达隐性基因的形状，更适合在细胞水平筛选突变体

植物细胞培养

1、植物细胞培养的应用

①植物次生代谢产物的生产

A生产天然的植物成分：

细胞培养可以得到大量的天然色素，其可以作为合成药物、食用色素和维生素的原料。

B生物转化：

一是给细胞提供在一般情况下植物所不具备的底物化合物，得到在自然界中所不存在的化合物，二是给细胞提供植物天然产物中间体，提高该种天然化合物在细胞中的产量

C细胞的工厂化生产：

通过细胞培养，将植物内合成某种特殊物质能力强的细胞帅选出来，使之投入工厂化生产

②突变体选择：

直接筛选法用于抗性变异的细胞选择，间接筛选可以用于表现型不具有选择上的优势

③诱导多倍体：

采用细胞培养可以是染色体加倍而恢复育性，使单倍体细胞加倍，获得纯和二倍体植株

2、人工种子研究的意义

①使自然条件下不易结实或种子昂贵的材料能快迅速繁殖和保存

②固定杂种优势

③得到的胚状体为基因工程技术应用于生产提供桥梁

④在人工种子的制作中，加入各种营养成分或生长调节剂，可以提高抗逆性，调节植物生长

⑤替代天然种子而节约粮食

植物原生质体培养及细胞融合

1、影响原生质体数量和活力的因素（分离效率）

①供试材料

供试材料是影响原生质体分离效率的主要因素之一。

供试材料一般选用愈伤组织、悬浮细胞系或植株上的外植体。

如果选用愈伤组织或悬浮细胞系，要注意选择继代后处于旺盛分裂时期的材料。

愈伤组织则同时要注意挑选淡黄色、颗粒状的材料。

如果选用植株上的外植体，应选择生长健壮植株上较幼嫩的组织，该类材料的原生质体产量高，活力强，培养后植板率高。

②酶的种类、组合和酶解时间

酶制剂的纯度、浓度、活性以及酶解处理时间显著影响原生质体的产量和活力。

要选择纯度高的酶类，酶的浓度不宜过高，酶解时间不宜过长，最好不超过8h。

5渗透压稳定剂

渗透压稳定剂主要可分为两大类：

一类是由糖醇或可溶性糖（如甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖）组成的有机溶液，目前大多采用这一类，。

另一类是无机盐溶液，由氯化钙、硫酸镁、氯化钾或培养基中的无机盐组成。

这类渗透压稳定剂的优点是原生质体的产量比用甘露醇的高；缺点是可降低细胞壁降解酶的活性，渗透压稳定剂的使用浓度不宜过高或过低，以细胞轻度质壁分离为宜。

6质膜稳定剂

为了提高质膜的稳定性和增加原生质体的产量，可在酶液中添加多聚阳离子和无机钙离子（CaCl2）作为质膜稳定剂。

7pH

酶液的pH对原生质体的产量和活力影响很大。

因植物材料不同所要求的pH有差异,一般为pH5.5～5.8。

如果原生质体的供体材料是植物组织器官酶液中应加入pH缓冲剂,以维持稳定酶液的pH

2、影响植物原生质体培养效果的主要因素

①原生质体活力：

选择发育健康植株上的外植体或旺盛分裂的愈伤组织，酶解处理时酶解剂浓度不要过高，时间不要过长，可以调高原生质体的活力

②原生体起始密度：

密度过高过低均影响其分裂

③渗透压稳定剂：

有甘露醇，葡萄糖

④培养基成分

A基本培养基：

主要有MS，B5等

B碳源：

葡萄糖

C无机盐浓度和氮的形态：

无机盐浓度不宜过高，铵态氮浓度不宜过高

D植物生长调节剂的浓度配比：

生长素主要用NAA、IAA、2,4-D，细胞分裂素用6-BA、LT、ZT

⑤培养条件

A光照：

培养初期不需要光照，当形成细胞团后再移到光下培养，强光抑制细胞分裂

B温度：

一般在26左右

⑥植物材料和基因型：

木本植物原生质体培养比一、二年生的草本植物困难得多。

木本植物又以多酚化合物含量高的植物原生质体培养最为困难。

植物体细胞无性系变异

1、体细胞无性系变异的优缺点

优点：

①适合于各种可进行组织培养的作物

②持续快速提供变异源

③消除优良品种的一个或几个缺陷

④提供新型变异株系

缺点：

①继代培养多次后，植株再生能力减弱

②一些变异经自交或杂交以后，表现不稳定

③这种变异没有可预见性，往往会产生一些不符合育种需要的变异

2、影响植物体细胞无性系变异的因素

①外植体：

培养分生组织组织或幼龄的外植体发生变异较少，培养特异化程度高或衰老的组织，产生变异的几率大

②物种和基因型：

体细胞无性系变异具有对物种和基因型的依赖性

③培养基

A基本培养基

B植物生长调节剂

④继代培养时间：

长时间的继代培养会使愈伤组织和细胞的变异频率增加，再生能力降低甚至完全丧失

3、植物体细胞无性系变异的机理

①预先存在的变异表达

②染色体数目变化

③点突变

④体细胞染色体交换及姐妹染色单体交换

⑤DNA复制和缺失

⑥转座因子的活化

⑦DNA甲基化

⑧胞质DNA的改变

⑨外遗传变异

植物离体繁殖

1、快繁的主要技术障碍

（1）褐变：

应对措施：

①及时转管；

②液体培养过渡；

③基质中添加Vc、活性炭等；

④外植体预处理（还原剂浸泡）

⑤选择木质化程度低的外植体；

（2）玻璃花苗：

是组培植物特有的一种生理失调现象，产生的试管苗生活力差，易衰亡。

A形态：

植株矮小，节间短，叶水渍状，半透明、脆易碎；

B生理：

含水量高，叶绿素少，木质化程度低，Pr、纤维含量低，酶活性异常；

C、克服方法：

原因措施

①CYT量过高改BA为2-ip或降低BA水平

②氮源供应降低NH4+水平（eg：

1/2MS－1/10MS）

③内源Eth增多加AgNO3

④琼脂量过低提高基质固化程度，降低水势，防止材料过多吸水

⑤温度，光照相应改变培养条件

（3）生根难：

是目前快繁技术的一个重要制约环节，针对不同情况有不同处理方法。

常用的策略：

a、降低培养基盐浓度；

b、适当增大IAA用量，不用或少用CYT；

c、减少糖供应、增加光照以增强植株的自养能力；

d、对难生根材料采取微体嫁接、化学刺激等方法处理；

2、植物快繁的全过程

1、阶段1---无菌培养物的建立

A母株和外植体的选取：

选择性状稳定，生长健壮，无病虫的成年植株

B无菌培养物的获得

C外植体的启动生长：

不同外植体启动生长的方式不同

2、阶段2---繁殖体增殖

A培养材料的增殖

B增殖培养基

C增殖体的大小和切割方法：

垂直插入培养基

3、阶段3---芽苗生殖

A离体生根，试管内生根

B活体生根，试管外生根

4、阶段4—小植株的移栽驯化

A移栽：

基质用保湿又透气的材料

B驯化管理：

光、温控制

4、影响植物快繁的因素

①外植体

A外植体的来源：

具有拟分生组织的外植体是最佳的快繁外植体

B外植体生理年龄

C外植体大小：

外植体越小，成活率和繁殖率越低

②培养基

A基本培养基

B植物生长调节剂

C培养基的物理性质

③培养条件

A光照

B温度

C湿度

D气体

④继代培养：

应注意调整激素浓度

⑤移栽

A根系结构：

不生根，根与输导组织不连接，无根毛

B叶表皮组织：

表皮蜡质层不发达，无表皮毛等

5、商业化生产应注意的问题

无病毒苗木的培育

1、植物脱毒方法

（1）物理方法：

如热处理法，在高温下，不能生成或生成病毒很少，而破坏却日趋严重，以致病毒含量不断降低，这样持续一段时间，病毒自行消灭，从而达到脱毒的目的。

（2）化学方法：

生长调节剂，RNA抑制剂处理病毒抗血清预处理

（3）生物学方法

A茎尖培养脱毒原理：

感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，在根尖和茎尖病毒含量很少或不含病毒，植物体内病毒靠维管束系统移动，分生组织中没有维管束存在，病毒只靠胞间连丝移动，速度很慢，难以追上生长活跃的分生组织，所以旺盛生长的根尖、茎尖一般都无病毒或很少有病毒分布（最常用）

a、病毒在植物体内的分布

茎尖、根尖分生组织不含病毒粒子或病毒浓度很低。

是因为病毒在寄主植物体内随维管系统（筛管）转移．在根尖与茎尖分生组织中没有维管束系统，病毒运动困难。

病毒在寄主茎尖分生组织中的转移速度落后于茎（根）尖的生长速度，导致顶端分生组织附近病毒浓度低，培养便可获得无病毒再生植株。

b、茎尖大小与脱毒效果

用于脱毒的茎尖外植体可以是顶端分生组织即生长点，最大直径0.lmm；通常是带1～3个叶原基的茎尖（约0.3～0.5mm）。

茎尖外植体的大小与脱毒效果成反比。

但不带叶原基的过小，外植体离体培养存活困难，生长缓慢，操作难度大。

茎尖分生组织不能合成自身需要的生长素，而分生组织以下的1～3个幼叶原基可合成并供给分生组织生长素、细胞分裂素。

因而带叶原基的茎尖生长快，成苗率高。

但茎尖外植体过大，脱毒效果差。

B愈伤组织培养脱毒：

通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗

C茎尖微体嫁接：

木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.4—1.0mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗

D珠心组织培养脱毒法：

病毒一般不通过种子传播，因而通过珠心胚培养获得的再生植株是无毒的，同时又保存了母株的遗传特性

（4）综合脱毒方法

茎尖培养结合热处理脱毒法茎尖培养结合病毒钝化剂处理脱毒法

植物种质资源离体保存

1、种质离体保存方式的优缺点

优点：

①所占空间少，节约大量的人力、物力和土地；

②便于种质资源的交流利用；

③需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖；

④避免自然灾害引起的种质丢失。

不足之处：

①对于限制或延缓生长的处理，需定期转移，连续继代培养；

②易受微生物污染或发生人为差错；多次继代培养有可能造成遗传性变异及材料的分化和再生能力的逐渐丧失

2、植物离体种质保存的主要方法

（1）限制生长保存：

A、低温保存

是限制生长应用最广方法：

一般是在1~9℃下培养，并经常同时提高培养基的渗透压。

在这种条件下，培养物的生长受到限制，继代培养时间间隔数个月至1年以上。

这对中、短期种质的贮存是非常合适的。

一旦要利用这些种质，只要把培养物转移到常温下培养，即可迅速恢复生长

B、高渗透压保存法

通过提高培养基的渗透压，达到抑制培养物生长速度的保存方法。

这种方法主要是通过影响离体培养物的吸收作用而减缓培养物的生长。

一般来说，离体培养物正常生长所便用的培养基蔗糖浓度为2%~4%，提高蔗糖浓度到10%左右，就可达到抑制培养物生长的目的。

提高培养基的渗透压还可采用外加甘露醇、山梨醇等惰性物质（不易被培养物吸收）来提高渗透压，这样可以使其限制离体培养物生长的作用维持更久

C、生长抑制剂（或延缓剂）保存法

常规组织培养的培养基中，通常是附加生长素或细胞分裂素，以促进外植体生长与发育。

但在离体种质资源保存中，则采取一定措施来延缓或抑制离体培养物的生长发育，达到保存种质的目的。

通常采用外源生长抑制剂（或延缓剂）来延缓培养物的生长。

最常用的是天然生长抑制剂ABA，具有抗赤霉素的作用，阻碍RNA聚合酶的活性，抑制DNA合成，从而达到抑制外植体生长的目的

D、降低氧分压保存法

通过培养容器内降低氧分压，改变培养环境的气体状况，能抑制离体培养物细胞的生理活性，延缓衰老，从而达到离体保存种质的目的，其原理类似于果蔬类的贮藏保鲜方法。

如

果培养容器内的氧分压太低，则会产生毒害作用

E、干燥保存法

水是生命活动的基质，降低培养物水分，其生命活动就能延缓，这与传统的种子干燥贮存类似

（2）超低温保存种质

①定义：

植物超低温种质保存是指将植物的离体材料包括茎尖、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温（－196℃液氮）条件下进行保存的方法

②超低温保存的基本原理：

低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结构就会遭到不可逆的破坏，导致细胞和组织死亡。

植物材料在超低温条件下之所以可以长期保存并能在离开保存环境后正常进行细胞分化，就是在冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分的次生结冰而达到植物材料保存目的

③超低温保存的基本程序

A、植物材料（培养物）选取：

选择遗传稳定性好、容易再生和抗冻性强的离体培养物作为保存材料是超低温保存离体种质成功的关键，已经研究或应用过的植物材料或培养物主要有三类：

①愈伤组织、悬浮细胞、原生质体；②花粉和花粉胚；③茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植株

B、材料预处理

预处理的目的是使材料适应将遇到的低温条件，提高新分裂细胞的比例，常采用的办法是对超低温保存的离体培养物进行低温预处理和加入冷冻防护剂，最好的冷冻防护剂是二甲亚砜（DMSO）

C、冷冻处理

常采用四种冷冻方法，即慢冻法、快冻法、预冻法和干冻法

D、冷冻贮存

由于液氮在不断挥发，所以，必须定时补充液氮以保证植物材料的持续保存。

如果冷冻在－196℃下的材料要长期贮存，则需一个液氮冰箱

E、解冻

解冻是将液氮中保存的材料取出，使其融化，以便进一步恢复培养。

解冻的速度是解冻技术的关键，解冻可分为快速解冻（fastthawing）和慢速解冻（slowthawing）两种方法

F、再培养

解冻后，有的材料需用培养基洗几遍后（去防护剂）再接种到新鲜培养基上进行再培养，有的材料洗涤后反而培养不活，应直接接种于新鲜培养基上。

有一部分材料在冷冻保存时被冻死，使得再培养的成活率达不到100%，因而需要测定培养物活力，以剔除没有生活力的培养物。

测定方法有FDA染色法、TTC还原法、EvansBlue染色法等

1、植物组织培养技术在园艺上的应用

（1）快速无性繁殖和工厂化育苗：

植物微繁殖是利用植物茎尖或茎尖分生组织为繁殖材料，在组织培养条件下大量繁殖的过程植物的微繁殖可使有限的优良单株“克隆”出成千上万株后代。

这一方法不受天气、土壤等外界条