感受态细胞制作.docx

感受态细胞制作.docx

《感受态细胞制作.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《感受态细胞制作.docx（11页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

感受态细胞制作

方法七：

Inoue法制备超级感受态细胞

越干净越好，越冷越好。

1、将洗干净的瓶子（500ml三角烧瓶）用Milli-Q水浸泡2-3小时，倒去烧瓶中的水并将烧瓶倒扣在吸水纸上2-3分钟。

用Milli-Q水配置250mlLB液体培养基。

高压灭菌。

2、准备两盒1.5mlEP管，每盒中放置两张吸水纸，共约两百个。

高压灭菌。

3、于早晨7-8点钟小摇菌种，挑取单菌落于5mlMilli-Q水配置且灭菌的LB液体培养基（无抗性）中，37℃培养12小时以上（OD600大于1.5）。

可以用一个新的50ml进口离心管（costa，BD等品牌都可以）来摇细菌。

4、晚上10点钟左右，按1：

100大摇细菌。

超静台内吸取2.5ml小摇细菌于高压灭菌的250mlSOB培养基（无抗性）中，18-22℃，200rpm摇过夜。

5、第二天上午测量细菌OD600值。

Top10,JM109等生长速度快的细菌约在上午9点左右OD600达到0.55左右，DH5α则要到下午4-6点钟（可以多摇几瓶细菌，梯度接菌，如1：

50，1：

100，1：

200等）。

6、将OD600达到0.55的细菌置于冰上10min（OD600在0.4-0.8之间都可以，对结果影响不大）。

7、4℃，4000rpm（2500g），10min集菌（用新的50ml进口离心管）。

8、超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上，大力向下击打，尽可能去掉剩余SOB（LB）。

9、每管倒入10ml预冷的Inoue转化缓冲液，拧紧盖子。

在冰上来回滑动重悬细菌（重悬的时间与向下击打的力度和来回滑动的速度相关，这两者与感受态效率没有直接关系）。

10、超静台内向每管倒入约30ml预冷的Inoue转化缓冲液，来回颠倒混匀，冰上10min。

11、4℃，4000rpm，10min集菌。

12、超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上（换一张吧，别用刚才那张），大力向下击打，尽可能去掉剩余缓冲液。

13、每管倒入10ml预冷的Inoue转化缓冲液，拧紧盖子。

在冰上来回滑动重悬细菌。

14、轻轻来回混匀（记住要轻轻）。

置于冰上10min。

15、将冰浴的感受态细胞分装到事先灭菌后并放到-20或4℃的EP管中，一个一个丢到液氮罐里，然后冻到-80（建议100μl每管，传说液氮速冻可以提高5倍的感受态效率）。

感受态效率在108-107不等。

Inoue法制备大肠杆菌超级感受态细胞

关键词：

 Inoue法 大肠杆菌 感受态2008-07-2100:

00 来源：

互联网 点击次数：

1515

实验步骤：

1、InoculatefromanovernightgrowninLB.从培养过夜的LB平板上挑取单菌落。

2、Growin250ml"SOB"at18℃untilOD600 =0.6.（0.3）接种于250mlSOB，18度培养至OD＝0.6。

3、Onicefor10minutes.菌液置冰上10分钟。

4、Spinat2500xg（5000rpminaSorvallGSAor3000rpminaBeckmanJ-6Bcentrifuge）for10min.at4℃.4度2500g离心10分钟。

5、Resuspendcellsgentlyin80mloficecold"TB".小心用80ml预冷TB重悬细胞。

6、Onicefor10minutes.（30min）菌液置冰上10分钟。

7、Spinat2500xg（5000rpminaSorvallGSA,5500rpminaSorvallSS-34,or3000rpminaBeckmanJ-6Bcentrifuge）for10min.at4℃.4度2500g离心10分钟。

8、Resuspendcellsgentlyin20mloficecold"TB".小心用20ml预冷TB重悬细胞。

9、AddDMSOtoafinalconcentrationof7%.加入DMSO至终浓度7%。

10、Placeonicefor10minutes.置冰上10分钟。

11、Aliquotinto1-2mlandfreezeinliquidnitrogen.分装，液氮速冻。

12、Storeinliquidnitrogenor-80oC.冻存。

SOBMediumandTB（TransformationBuffer）

SOB 

2%（w/v）bactotryptone 

TB 

0.5%（w/v）yeastextract 

10mM Pipes 

10mM NaCl 

55mM MnCl2 

2.5mM KCl 

15mM CaCl2 

10mM MgCl2 

250mM KCl 

10mM MgSO4 

在加入MnCl2之前先用5NKOH调pH值到6.7，adjustpHto6.7with5NKOHpriortoaddingtheMnCl2 

thankstoMarkusSchneemannforthetip

pH6.7-7.0 

Note:

Competentcellsarefragile（cellwallisthoughttobeweakened）,thereforetreatthecellsgentlywhenpreparingthesecells.Donotvortexorpippetteupanddowntoresuspendthecells.Donotspinthecellsattoogreataspeed（spinningdownat5000gwillcausesomecellstolyse）.

Alwayskeepthecellschilledwhenmakingcompetentcell.Donotletthemwarmup.

Freezingthecellsappeartomakecellsmorecompetent.

Somecellstrainsmayworkbetterthanothers（DH5alphaworkswellinmyhand）.Notealsothatsomecells（e.g.HB101）hasgreaterrecombinationactivitythanothers.

Thismethoddoesn'tappeartoworkwithBL21,sojustgrowthecellsat30or37℃whenmakingBL21competentcells.However,ithasbeensuggestedthattheefficiencyofBL21preparedusingInouemethodmaybeimprovedbytreatingitwithDTTbeforefreezing（addto3.5%v/vofa2.2MDTT,10mMKAcpH6solutionandincubate10minutesonice）.

Heatshocktimeshouldbedeterminedfordifferentstrainsofcell.ForDH5alphaorJM109use30-45sec.ForBL21use120sec.

Deactivateligasepriortotransformation.Ligasemayreducetransformationefficiency.

Dilutingtheligationmixture（~5x）canalsoincreasetransformationefficiecybyreducingtheamountofreagents/contaminantsthatmayaffecttransformation.Likewiseithasbeensuggestedthatphenol/chloroformtreatmentmayalsoincreaseefficiency,butitisprobablytoomuchtroubletobothertrying.

TheDNAaddedshouldnotbemorethen5%ofthevolumeofcompetentcellsused.ThefinalDNAconcentrationshouldnotexceed5ng/μl.

Themethodaboveshouldgiveatransformationefficiencyofmorethan108cfuperμgofplasmidDNA（pUCorpBluescripts）withover109cfupossible.

Transformationefficiencyhasaroughlyinverserelationshipwiththesizeofplasmids.CellswithdeoRmutaion（e.g.DH5alpha）canimprovedthetransformationoflargeplasmid.Relaxedplasmidshas~3/4ofthetransformationefficiencyofsupercoiledplasmid.

2differentplasmidscanbetransformedatthesametime,oroneafteranother.Buttheymustbecompatible（theycannothavethesamereplicon）.

Forroutinetransformationwherebyefficiencyoftransformationisofnoimport,someofthestepsmaybeshortenoromitted.Forexample,heat-shockstepmaybeunnecessaryandrecoveryincubationtimeat37℃canbereducedoromitted（butdonotethatthismaydependsontheantibioticusedforselection- forampicillin-typeantibioticstheincubationtimeisnotreallythatimportant,thereforeyoucanplatethecellsstraightafterheat-shockifyouwish.forotherantibiotics,however,theincubationtimemaybeessential）.

Platingcells- dry1.5%agarplates（exposedupsidedown）at37℃for2-4hoursjustbeforeuse,theplateshouldbeabletosoakupto0.8-1mlofmediawhenplating.Forblue-whiteselection,itisnotnecessarytomakeX-galplate,justaddX-gal+ IPTGdirecttocells,mixandthenplate.

Detergentsmaybedetrimentaltothetransformabilityofthecompetentcells,thereforetheglasswareusedformakingcompetentcellsshouldnotbewashedwithdetergents.Polycarbonateflaskmayalsobeusedinsteadofglassflask.DMSOcandissolvepolystyrene,thereforeusepolypropylenetubes.

Whencloningdifficultandlessstablesequence（e.gpalindrome,repeats,LTRsequences）,ithelpstogrowtransformcellsatlowertemperatures（25-30℃orroomtemperature）inveryrichmedia（e.g.TerrificBroth）.Alsoterminategrowthbeforereachinglatestationarygrowthphasewhengrowninliquidmedia（i.eharvestcellsatOD550 between1and2）.Useofstabilizingstrainisalsouseful.

Thereareothermethodsofmakingcompetentcells- e.g.CaCl2 method,RbClmethodwhichismoreeffectivethanCaCl2 method.Electroporationissupposedtogivehigherefficiency（upto1010transformantsperμgplasmidclaimed）,butforthesimplecloningthatwedo,itsuseisnotwarranted（andit'smoreexpensive,moretroublethanit'sworth,etc.）.

Ifacoolingshakerisnotavailable- growthecellsatroomtemperature.MorediscussionsonmakingcompetentcellaswellasreferencescanbefoundinTIBSarticles"Preparingμltra-competentE.coli"and"Bettercompetentcells"

Itisalsopossibletotransformcellsstraightfromplate.Itisconvenientbutyoushouldexpectlowefficiency.Seethefollowingreferenceformoredetails（aswellasmoreinformationoncompetentcellsandotherprotocols）:

本文引自：

Hanahanetal,MethodsinEnzymology204,63

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法

感受态细胞（Competentcells）：

常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。

受体细胞经过一些特殊方法（如：

CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞（competentcell）。

转化：

是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。

进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

α-互补现象：

因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。

当这种载体转入可编码?

－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。

所以称这种现象为α-互补现象。

由互补产生的α-半乳糖苷酶（LacZ）能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ（α）基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。

所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。

方法一：

TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）

一、准备工作

1、缓冲液1×TSS的配制

事先配制1M的氯化镁：

20.3g氯化镁（6分子水结晶），定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。

取干净的100ml量筒和100ml烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取1g蛋白胨，0.5g酵母抽提物，0.5g氯化钠，10gPEG（MW=3350），5mlDMSO，5ml的1M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um滤器过滤除菌。

储存在4度，保质期约6个月。

2、已划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养的菌种—Dh5α，用于接种并振荡培养。

两个锥形瓶，分别装有30ml和50mlLB，灭菌后置于4℃冰箱备用。

3、若干已灭菌的琼脂平板，一个未加抗生素，用于第二步的接种，其余做转化用。

二、感受态制备程序

前一天晚上调单菌落至30mlLB中过夜培养（12-16h），按1：

100比例将过夜培养的菌液（500ul）加入到新鲜的50mlLB培养液中，于37℃振荡培养至OD600约为0.4（培养时间2h40～50min）。

冰浴30分钟后4度1000g离心10min，弃上清，收获细菌。

加入原体积十分之一（这里为5ml）的1×TSS液（冰预冷）悬浮细胞，然后分装成100μl/份，全部冰上操作，-80℃保存。

三、转化

取一管（100μl）感受态细菌，（冻存细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用）加入3-5μlDNA（0.1～100ng），轻轻混匀后冰浴30min。

加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培养液，37度150r/min温和振荡培养60min，涂布，室温放置约20分钟后放于37度恒温培养箱过夜培养（17-20h）。

方法二：

CaCl2法

细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。

　　用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。

本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。

　　1．从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH5α），或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。

于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。

　　2．在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。

　　3．于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。

　　4．倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

　　5．以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上10min。

　　6．于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。

　　7．倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

　　8．每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1MCaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。

　　9．用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。

　　10．将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管。

　　11．快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。

　　12．每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

　　13．将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/lMgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。

　　14．将平板置于室温至液体被吸收。

　　15．倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。

方法三：

CASsuperOne-StepCompetentCellPrepsKit

采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。

与CaCl2法相比具有多种优点：

使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCl2法，一般可达106-108cfu/μg，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70℃，无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。

一、准备工作

1．从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在LB平板上划线，37℃过夜至长出单菌落。

挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5mlLB培养基中，37℃，250rpm，过夜培养。

2．次日从5mlLB培养物吸取200μl转入50mlLB培养基中（250ml锥形瓶），37℃，250rpm培养2小时，此时OD600约0.4—0.5。

二、感受态细胞的制备

3．吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟，弃去上清。

4．加入100μl预冷的SolutionA，悬浮菌体，冰浴30分钟。

5．此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。

三、细胞转化

6．在感受态细胞中加入100pg-1