无菌检查法药品无菌检查规程.docx

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无菌检查法药品无菌检查规程

无菌检查法药品无菌检查规程

一、目的：

阐述无菌检查规程。

二、适用范围：

适用于无菌检查规程。

三、责任者：

品控部。

四、正文：

1概述

无菌检查是检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于中国兽药典要求无菌检查的其它品种是否染有活菌的一种方法。

无菌检查的操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作。

该检查法根据供试品有无抑菌作用而采用薄膜过滤法或直接接种法两种方式。

2仪器、设备和用具

2.1无菌室分无菌操作室和缓冲间。

在缓冲间应有洗手盆、毛巾、无菌衣裤放置架及挂钩、拖鞋等。

无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置，局部洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温控（25±2）℃及除湿装置。

缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外灯和照明灯，操作室或工作台应保持正压。

2.1.1无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭或2%甲酚液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，开动无菌空气过滤器及紫外灯杀菌半小时。

在每次操作完毕，同样上述消毒溶液擦拭工作台面，除去室内湿气，用紫外灯杀菌半小时。

2.1.2无菌室的无菌程度检查无菌室在消毒处理后，无菌试验前及操作过程中需检查空气中菌落数；取直径约90mm双碟，在接种室内点燃乙醇灯，在乙醇灯旁，以无菌操作，将双碟半开注入溶化的营养琼脂培养基约20ml，制成平板，在30～35℃培养48小时，取出检查，100级清洁度要求:

3个平板上生长的菌落数平均不得超过1个。

无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪）检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个/升；空气流量应控制在0.75～1.0m3/S；细菌菌落数平均＜1个，可根据无菌状况必要时置换过滤器。

2.3恒温培养箱及可调20～25℃的生化培养箱。

2.4离心机、显微镜、蒸汽灭菌器、标准PH比色器（0.02%酚磺酞指示液和溴钾酚蓝指示液）、恒温烤箱。

2.5玻璃器皿试管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管（1、5、10ml）、注射器（2、5、10ml）、双碟等，用玻璃洗涤剂或清洁液浸泡，水洗3次。

使用过后如与细菌接触，应先灭菌倒出内容物后再清洗，晾干。

凡无菌操作过程中所用的器皿，都应用牛皮纸包扎严密，121℃灭菌30分钟，或置于耐热容器中盖妥160℃干热灭菌2小时。

2.5.1移液管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞少许棉花，然后放于吸管筒内或牛皮纸袋内，盖严，灭菌备用。

2.5.2试管、离心管、三角瓶等在管（瓶）口塞上海棉胶专用塞或纱布棉塞，塞子应塞进管口内2/3之处，用牛皮纸将管口（包括塞子）包扎严，灭菌备用。

2.5.3将注射器、针头（9号、11号、12号）配对，检查针头是否畅通后，将注射芯、管和针头分别放在双层纱布（或布）内，包扎严密，置带盖容器（瓷盘或铝制饭盒）内，盖严，用牛皮纸包扎后，灭菌备用。

2.6无菌衣、裤、帽、口罩等洗净晾干，配套，用牛皮纸包严，灭菌备用或用一次性的无菌物品代替。

2.7长柄取样匙，放于长的玻璃筒内（或不锈钢长筒内），盖严，干热灭菌备用。

2.8微孔滤膜直径50mm、孔径0.45μm。

购得一批滤膜，需进行孔径大小的测试，一般有三种方法，选其中一种方法即可。

气泡法先将滤膜浸入水中，使完全湿润，然后用镊子夹住一片滤膜放于气泡点测定装置或滤膜孔径测定仪上，膜上放一块与滤膜大小相同的尼龙筛网，再加上多孔板，将螺旋固定圈旋紧，在多孔板上加3～5mm深的水（注意排除气泡）关闭放气阀，启动空压机或氮气瓶阀，使压力缓缓上升，注意观察水面上产生第一个气泡时，记录压力表的压力，气泡点压力不应小于2.2kg/cm2（0.2MPa）

水流量法将滤膜装于除菌滤器上，开动真空泵，压力在700mmHg（93kPa）下，抽滤已滤清的水约500ml，计算出每1min的滤速。

1995年版中国兽药药典对滤膜的滤速明确规定，而USP（XXⅢ）规定在700mmHg（93kPa）压力下，滤膜直径47mm；流速55～75ml/min。

细菌过滤法常用的细菌为粘质沙雷氏菌（SerratiamarcescensCMCC（B）41002），将该菌的新鲜营养琼脂斜面培养物，接种于营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～20小时，用无菌0.9%氯化钠溶液稀释至10－3（约相当于7×105CFU/ml），取此菌液1ml加至50ml无菌0.9%氯化钠溶液中，按薄膜过滤法过滤，取该滤液5ml接种于营养肉汤培养基40ml中，30～35℃培养24小时，应无菌生长。

不符合规定的滤膜不得使用。

2.9除菌滤器目前有多种滤器；如STV2型无菌检查薄膜器及封闭式滤器的准备分述如下：

2.9.1STV2型无菌检查薄膜滤器是由除菌过滤器和底座排液架两部分组成。

新购置的滤器，需用毛刷将该滤器的各部件用水刷净，除去垢物，用水冲洗4～5次，蒸馏水冲洗1次。

玻璃筒放于玻璃洗涤液或清洁液中过滤，再用水、蒸馏水洗净、晾干。

除菌过滤器的装配在滤器的漏斗部上面置1个橡胶圈，圈上加多孔垫板，在垫板上垫一个四氯乙烯薄膜垫圈，放上乙浸湿的微孔滤膜1片，在其上垫一个四氯乙烯薄膜圈及橡胶圈，安装玻璃筒，套上金属固定架，拧上底部螺母，漏斗底部套上橡皮塞。

将已装配妥的滤器放于带盖的瓷盒（或饭盒）中，盖严，外用牛皮纸包扎灭菌备用。

底座排液架的排液管口接一耐压橡胶管，将管口用纱布，牛皮纸包扎灭菌备用。

该架经灭菌后放于无菌室内可反复使用。

2.9.2封闭式滤器一般由电脑集菌仪和一次性使用集菌培养器组成。

前者放于无菌操作区台面上。

2.10手术镊、手术剪洗净、擦干。

用双层纱布将1把剪和1个镊间隔包扎在一起

2.11抽滤瓶一般为1000～2000ml，用水及蒸馏水洗净，晾干。

瓶口用已配有两个玻璃管（一个通至瓶底，一个短些）的橡皮塞盖紧，短的玻璃管上套一个短耐压橡胶管。

抽气口用耐压橡胶管与空气过滤玻璃器（内充填以棉花）相连，空气过滤玻璃器的另一管口用纱布、牛皮纸包扎严紧，抽气瓶的全部装置用牛皮纸包扎，灭菌备用。

2.12用具的灭菌将包扎妥的用具（除另有规定外）在（121±0.5）℃蒸气灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，易致染菌。

应置恒温培养箱中烘干。

适于高温灭菌的器皿也可采用160℃干热灭菌2小时。

3试液

3.175%乙醇溶液配制酒精棉球用。

3.2碘酊溶液配制碘酒棉球用。

3.3无菌0.9%氯化钠溶液，分装于试管、三角瓶或玻璃瓶中，瓶口用棉塞、橡胶塞或海绵胶专用塞塞紧并用牛皮纸包扎，灭菌备用。

也可用氯化钠注射液。

3.4新洁尔灭（1：

1000）溶液。

3.53～5%甲酚磺溶液或其他适宜消毒溶液。

3.60.02%酚磺酞指示液PH6.8～8.4系列比色液管。

3.7溴甲酚蓝指示液PH6.0～7.6系列比色液管。

3.82mol/L盐酸溶液。

3.92mol/L氢氧化钠溶液。

3.10无菌的青霉素酶溶液。

4培养基

4.1一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的PH值应符合规定，否则必须校正后，灭菌使用。

4.2新鲜配制的培养基，应按中国兽药典规定的处方，对培养基的原材料要进行挑选，化学药品均需用CP试剂规格。

4.2.1除葡萄糖和指示液外，将处方中各成分加水后置有石棉网的电炉或适宜的加热设备中，使微温溶解。

用2mol/L氢氧化钠溶液调节PH，使其比规定的PH值略高0.4～0.6，煮沸，用棉（纸）浆减压抽滤或以脱脂棉，滤纸等滤材过滤，使培养基澄清。

4.2.2加入葡萄糖和指示液，摇匀，补足水量，调节PH值（比规定的PH值略高0.2～0.4），使灭菌后为7.1±0.2，分装，装量不宜超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。

4.3培养基灵敏度检查

新购的脱水培养基或采用不同品牌原材料的配制的新鲜培养基，其质量均应符合灵敏度检查要求。

4.3.1菌种

（1）腾黄微球菌[MicrococcusluteusCMCC（B）28001]

（2）生孢梭菌[ClostridiumsporogenesCMCC（B）64941]

（3）白色念珠菌[CandidaalbicansCMCC（F）98001]

4.3.2操作

4.3.2.1需气菌、压气菌培养基用腾黄微球菌和生孢梭菌两种菌检查。

取藤黄微球菌的营养琼脂斜面新鲜培养物，加无菌0.9%氯化钠溶液3ml，制成均匀的菌悬液，再以无菌0.9%氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标准管相同的浓度，然后作10倍系列稀释，制成1ml中含10～100个菌（CFU）并计数。

取生孢梭菌的需气菌、厌气菌培养基的新鲜培养物，用灭菌毛细管将其吸至灭菌离心管内，离心，弃去上清液，取沉淀菌体用无菌0.9%氯化钠溶液制成均匀菌悬液，吸取上述菌悬液，用无菌0.9%氯化钠溶液稀释，照上述方法制成1ml中含10～100个菌并计数。

4.3.2.2真菌培养基用白色念珠菌检查

取白色念珠菌的真菌琼脂斜面新鲜培养物，加无菌0.9%氯化钠溶液3ml，制成均匀的菌悬液，照藤黄微球菌项下方法稀释制成1ml中含10～100个菌并计数。

4.3.2.3取藤黄微球菌的营养肉汤，生孢梭菌的需气菌厌气菌培养基的新鲜培养物，白色念珠菌的真菌培养基的新鲜培养物各1ml，用无菌0.9%氯化钠溶液作10倍系列稀释，制成1ml中含10～100个菌并计数。

4.3.2.4将藤黄微球菌的上述之一的稀释液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的需气菌、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述之一的稀释液各1ml，分别接种至每管装量为12ml的需气菌、厌气菌培养基3管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天，并逐日记录结果。

4.3.3结果判断以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。

4.4配制的培养基应保存在凉暗处，一般不得超过2周，临用前细菌和真菌培养基分别经30～35℃和20～25℃培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长后方可使用。

4.5需气菌、厌气菌培养基的指示剂氧化层不得超过培养基深度的1/5，否则经水溶煮沸10分钟，但只限加热一次。

无菌试验培养时间结束时，指示剂氧化层应不超过培养基深度的1/2。

5对照用菌液的制备

5.1试验用菌种、菌种的复苏、转种与保存等均应按照“抗生素微生物检定法”标准操作规程项下操作。

5.2金黄色葡萄球菌菌液用接种环取金黄色葡萄球菌[StaphylococcusauteusCMCC（B）26003]的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至需气菌、厌气菌培养基内，在30～35℃培养16～18小时，用无菌0.9%氯化钠溶液稀释制成每1ml中含1～100个菌。

5.3生孢梭菌菌液用接种环取生孢梭菌[ClostridiumsporogonesCMCC（B）64941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物少许，接种至相同的培养基内，在30～35℃培养18～24小时，用无菌0.9%氯化钠溶液稀释制成每1ml中含1～100个菌。

5.4白色念珠菌菌液用接种环取白色念珠菌[CandidaalbicansCMCC（F）98001]的真菌琼脂培养基斜面培养物少许，接种至真菌培养基内，在20～25℃培养24小时，用无菌0.9%氯化钠溶液稀释制成每1ml中含1～100个菌。

5.5上述制备的菌液，一般当日使用。

6抑细菌和抑真菌试验

取每管装量为9ml的需气菌、厌气菌培养基4管及真菌培养基2管，分别接种金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、白色念珠菌10～100个菌各两管，其中1管加供试品规定量，按规定的温度培养3～5日，如培养基各管24小时内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用。

如加供试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢或不生长，均判断为