生物化学实验教学内容.docx
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生物化学实验教学内容
生物化学实验
第一节基本要求
一、内容提要
基础生物化学实验内容，主要以植物材料为研究对象。
实验项目包括糖类、脂类、蛋白质和氨基酸、核酸、酶、维生素的测定，既有定性又有定量。
实验内容编排不求齐全，而力求原理阐述简明扼要，通俗易懂，方法可靠，操作具体详尽，重复性好，灵敏度高。
实验方法涉及传统的滴定法以及分光光度法、层析法和电泳等现代生物化学实验技术。
本实验指导可供高等农业院校农学类、生物技术以及相关专业的本、专科学生使用，也可供从事与生物科学有关的科研工作者阅读与参考。
在以惊人速度发展的生物科学中，生物化学是其中最活跃的分支学科之一，它已成为发展生命科学各分支学科和生物工程技术的重要基础。
作为一门研究生命活动基本规律的科学，它又是一门实验科学。
工业、农业、医药、食品、能源、环境科学等越来越多的研究领域都以生物化学理论为依据，以其实验技术为手段，生物化学已成为高等院校许多相关专业学生必修的专业基础课程。
根据高等农业院校农学类专业教学计划，基础生物化学课程是一门重要的专业基础课；并且又是实践性极强的应用学科。
只有掌握扎实而广泛的基础知识和熟练的操作技能才算真正掌握好这门应用科学。
因此，我们组织编写这本基础生物化学实验指导。
本实验指导主要是配合基础生物化学教材，供高等农业院校农学类、生物技术以及相关专业的学生使用。
实验多以植物材料为主要研究对象；以生物大分子——碳水化合物、核酸、蛋白质和酶等为主要研究内容。
实验方法涉及到分光光度法、层析、电泳等现代生物化学实验技术。
在实验内容编排上，既有定性的又有定量的；实验教材由基础生物化学实验和附录两部分组成。
实验部分列出的实验项目包括糖类、脂类、蛋白质和氨基酸、核酸、酶、维生素的测定，有些项目包括几种不同方法，每一实验方法分为目的、原理、实验材料、仪器和试剂、操作步骤、结果计算、注意事项、思考题及参考答案。
本实验指导从一定角度反映了我国生物化学研究技术目前的水平和状况，内容不求全，而力求其可靠性和方法性。
在编写过程中，力求做到原理阐述简明扼要，通俗易懂，方法操作具体详尽，重复性好，灵敏度高，且注重培养学生严谨的科学态度，独立分析、解决问题的能力，为提高其良好的科研素质奠定基础。
本实验指导的出版是集体劳动的结晶。
主要由在教学第一线多年从事基础生物化学理论与实验课教学与研究工作的教授、副教授和具有博士、硕士学位的中青年教师等共同编写。
正是他们长期不懈的辛勤劳动以及在编写工作中给予的极大支持，才使本实验指导得以顺利出版。
特别是陈祖洁教授始终关注本实验指导的编写进程，在百忙中审阅了全部稿件并提出许多宝贵意见。
编者在此一并表示深深的谢意。
由于我们的经验和水平有限，加之时间较仓促，书中难免出现不妥甚至错漏之处，我们真诚希望广大读者在参考使用中不断向我们提供宝贵的批评和建议，以臻逐趋完善。
编者于山西农业大学2005.6.10
二、实验记录及实验报告
每次实验要做到课前认真预习，实验操作中仔细观察并如实记录实验现象与数据，课后及时完成实验报告。
1．课前预习
实验课前要将实验名称、目的和要求、实验内容与原理、操作方法和步骤等简单扼要地写在记录本中，做到心中有数。
2．实验记录
从实验课开始就要培养严谨科学作风，养成良好习惯。
实验条件下观察到的现象应仔细地记录下来，实验中观测的每个结果和数据都应及时如实地直接记在记录本上，记录时必须使用钢笔或圆珠笔，并做到原始记录准确、简练、详尽、清楚。
如称量试材样品的重量、滴定管的读数、分光光度计的读数等，都应设计一定的表格准确记下正确的读数，并根据仪器的精确度准确记录有效数字。
例如，光密度值为0.050，不应写成0.05。
每一个结果至少要重复观测两次以上，当符合实验要求并确知仪器工作正常后再写在记录本上。
另外，实验中使用仪器的类型、编号以及试剂的规格、化学式、分子量、准确的浓度等，都应记录清楚，以便总结实验完成报告时进行核对和作为查找成败原因的参考依据。
如果发现记录的结果有怀疑、遗漏、丢失等，都必须重做实验。
3．实验报告
实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。
按照实验内容可分为定性和定量两大类，实验报告的格式：
实验序号，实验名称；
（1）目的和要求
（2）内容与原理
（3）主要仪器及试剂配制
（4）操作方法与实验步骤
（5）结果与讨论
定性实验报告中的实验名称和目的要求是针对该次实验课的全部内容而必须达到的目的和要求。
在完成实验报告时，可以按照实验内容分别写原理、操作方法、结果与讨论等。
原理部分应简述基本原理。
操作方法（或步骤）可以流程简图的方式或自行设计的表格来表示。
结果与讨论包括实验结果及观察现象的小结、对实验课遇到的问题和思考题进行探讨以及对实验的改进意见等。
定量实验报告中，目的和要求、原理以及操作方法部分应简单扼要的叙述，但是对于实验条件（试剂配制及仪器）和操作的关键环节必须写清楚。
对于实验结果部分，应根据实验课的要求将一定实验条件下获得的实验结果和原始数据进行认真记录、整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始数据及其处理的表格、标准曲线图以及比较实验组与对照组实验结果的图表等。
另外，还应针对实验结果进行必要的说明和分析。
讨论部分可以包括：
关于实验方法（或操作技术）和有关实验的一些问题，如实验的正常结果和异常现象以及思考题进行探讨，对于实验设计的认识、体会和建议，对实验课的改进意见等。
第二节实验内容、方法原理及操作要领
第一节碳水化合物
实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法
一、目的
掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、原理
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料
小麦面粉；精密pH试纸。
2．主要仪器
（1）具塞玻璃刻度试管：
20mL×11
（2）大离心管：
50mL×2
（3）烧杯：
100mL×1
（4）三角瓶：
100mL×1
（5）容量瓶：
100mL×3
（6）刻度吸管：
1mL×1；2mL×2；10mL×1
（7）恒温水浴锅
（8）沸水浴
（9）离心机
（10）扭力天平
（11）分光光度计
3．试剂
（1）1mg/mL葡萄糖标准液
准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂
将6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。
（3）碘-碘化钾溶液：
称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。
（4）酚酞指示剂：
称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。
（5）6MHCl和6MNaOH各100mL。
四、操作步骤
1．制作葡萄糖标准曲线
取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1葡萄糖标准曲线制作
管号
1mg/mL葡萄糖标准液
（mL）
蒸馏水（mL）
DNS（mL）
葡萄糖含量
（mg）
光密度值（OD540nm）
0
0
2
1.5
0
1
0.2
1.8
1.5
0.2
2
0.4
1.6
1.5
0.4
3
0.6
1.4
1.5
0.6
4
0.8
1.2
1.5
0.8
5
1.0
1.0
1.5
1.0
6
1.2
0.8
1.5
1.2
将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。
调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。
以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。
2．样品中还原糖和总糖的测定
（1）还原糖的提取
准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。
将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心管中，于4000r/min下离心5min，沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。
（2）总糖的水解和提取
准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL6MHCl，置沸水浴中加热水解30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。
待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。
将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。
（3）显色和比色
取4支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。
加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。
表2样品还原糖测定
管号
还原糖待测液（mL）
总糖待测液（mL）
蒸馏水（mL）
DNS（mL）
光密度值（OD540nm）
查曲线葡萄糖量
（mg）
7
0.5
1.5
1.5
8
0.5
1.5
1.5
9
1
1
1.5
10
1
1
1.5
五、结果与计算：
计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。
还原糖（%）=
查曲线所得葡萄糖毫克数×
提取液总体积（ml）
测定时取用体积（ml）
×100
样品毫克数
总糖（%）=
查曲线所得水解后还原糖毫克数×稀释倍数
×0.9×100
样品毫克数
六、附注
1．离心时对称位置的离心管必须配平。
2．标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。
3．面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。
七、思考题
1．3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的?
2．如何正确绘制和使用标准曲线?
参考答案
1．植物中的总糖包括单糖、寡糖和多糖，单糖是还原糖，可直接测定。
而没有还原性的寡糖和多糖，需用高浓度的酸在加热的条件下水解成有还原性的单糖，还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成一定比例关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需要加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
2．标准曲线应在坐标纸上绘制，横坐标轴距坐标纸底边1.5~2cm，标示出刻度和葡萄糖的毫克数；纵坐标轴距坐标纸左边1.5~2cm，标示刻度和光密度值；曲线为过原点的直线，测定点均匀分布在直线的两侧；标准曲线只能在测试条件完全相同的情况下，用于确定样品中的物质含量。
对于重复的测定，应取吸光度的平均值查标准曲线；测定数据不应记在标准曲线上。
实验二还原糖含量测定——砷钼酸比色法
一、目的
植物体内的还原糖主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。
它们在植物体内的分布，不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是合成其它成分碳架来源和呼吸作用的基质。
此外，水果、蔬菜中含糖量的多少，也是鉴定其品质的重要指标。
其它碳水化合物，如淀粉、蔗糖等，经水解也生成还原糖。
因此，测定还原糖的方法在研究植物体内生理生化变化和测定植物体内碳水化合物方面都是很重要的。
二、原理
还原糖是具有羰基（>C=O）的糖，能将其它物质还原而其本身被氧化。
（1）还原糖在碱性条件及有酒石酸钾钠存在下加热，可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子，产生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。
具体反应如下：
（2）氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物——砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖的含量（即被还原的Cu2O量）成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后做标准，就可测得样品还原糖含量。
Cu2O+H2SO4
Cu+
2Cu++MoO42-+SO42-
2Cu2++蓝色复合物
CuSO4+2NaOHNa2SO4+Cu（OH）2
三、实验材料、主要仪器和试剂
1．实验材料：
苹果、面粉等
2．主要仪器
（1）分光光度计
（2）水浴锅
（3）具塞刻度试管：
20mL×10
（4）刻度吸管：
1ml×1，2ml×4，5ml×3
（5）容量瓶：
100ml×2
（6）漏斗
（7）研钵
3．试剂
（1）铜试剂：
A、4％CuSO4•5H2O
B、称取24g无水碳酸钠，用850mL水溶于大烧杯中，加入2g含4分子结晶水的酒石酸钾钠，待全溶（应加热）后加入碳酸氢钠16g，再加入120g无水硫酸钠（加热），全溶及冷却后加水至900mL，沉淀1～2d，取上清液（要求严格时过滤）备用。
使用前将A与B按1∶9混匀即可使用。
（2）砷钼酸试剂：
25g钼酸铵（NH4）6Mo7O24·4H2O溶于450mL蒸馏水中（加热溶解，但温度接近150℃时易分解），待冷却后再加入21mL浓H2SO4混匀。
另将3g砷酸氢二钠（Na2HAsO4·7H2O）溶解于25mL蒸馏水中，然后加到钼酸铵溶液中，室温下放置于棕色瓶中可长期使用。
（3）200μg／mL标准葡萄糖原液：
准确称取分析纯葡萄糖200mg，溶解定容到1000mL。
四、操作步骤
1．标准曲线的制作：
在一系列刻度试管中，分别加入200μg／mL标准葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5及0.6mL，再顺序加入蒸馏水2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5及1.4mL，配成浓度分别为0、10、20、30、40、50及60μg/mL的系列葡萄糖溶液。
每试管加入铜试剂2mL，混匀后沸水浴中加热10min，立即冷却，再加入2mL砷钼酸试剂，振荡两分钟后稀释到20mL，用分光光度计在620nm波长下比色，测其光密度OD620nm（做一式两份）。
以糖浓度微克数为横坐标，光密度OD620nm为纵坐标，绘制标准曲线。
2．植物样品中还原糖的提取：
将样品洗净，吸干其表面水分，切碎混匀，称取1g放入研钵中，加入约0.5g石英砂，磨成匀浆，加水将样品由玻璃漏斗冲入100mL容量瓶中，加水达70～80mL，摇匀后置于80℃恒温水浴上浸提0.5h。
待上述样品冷却后，沉淀蛋白质，加入5％硫酸锌5mL，再慢慢滴入0.3mol/LBa（OH）25mL，以沉淀蛋白质。
振荡后静置，至上层出现清液后再加一滴Ba（OH）2，直至无白色沉淀时，向容量瓶加水至刻度。
3．还原糖含量的测定：
过滤上述已定容的样品液，取5mL滤液，再定容到100mL（此步视样品的含糖量而定）。
取已稀释的溶液2mL，与标准葡萄糖显色法相同：
加铜试剂2mL，煮沸10min，加砷钼酸试剂2mL，振荡2mL，定容到15ml，620nm波长下比色，记下光密度OD620nm（至少重复两次）。
五，结果计算
还原糖含量（％）=
G×稀释液倍数
W×106
式中：
G——从标准曲线上查得含糖量（μg）
W——样品重（g）
六、思考题
举例说明哪些是还原糖？
参考答案：
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中果糖、乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖、淀粉和纤维素等是非还原糖。
第二节脂类
实验一脂肪碘值的测定
一、目的
掌握测定脂肪碘值的原理和操作方法，了解测定脂肪碘值的意义。
二、原理
不饱和脂肪酸碳链上含有不饱和键，可与卤素（Cl2，Br2，I2）进行加成反应。
不饱和键数目越多，加成的卤素量也越多，通常以“碘值”表示。
在一定条件下，每100g脂肪所吸收碘的克数称为该脂肪的“碘值”。
碘值越高，表明不饱和脂肪酸的含量越高，它是鉴定和鉴别油脂的一个重要常数。
碘与脂肪的加成反应很慢，而氯及溴与脂肪的加成反应快，但常有取代和氧化等副反应。
本实验使用IBr进行碘值的测定，这种试剂稳定，测定的结果接近理论值。
溴化碘（IBr）的一部分与油脂的不饱和脂肪酸起加成作用，剩余部分与碘化钾作用放出碘，放出的碘用硫代硫酸钠滴定。
加成反应：
释放碘：
IBr+KI
KBr+I2
滴定：
I2+2NaS2O3
2NaI+Na2S4O6
实验时取样多少决定于油脂样品的碘值。
可参考表1与表2：
表1样品最适量和碘值的关系
碘值（g）
30以下
30~60
60~100
100~140
140~160
160~210
样品数（g）
约1.1
0.5~0.6
0.3~0.4
0.2~0.3
0.15~0.26
0.13~0.15
作用时间（h）
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.0
表2几种油脂的碘值
名称
亚麻子油
鱼肝油
棉子油
花生油
猪油
牛油
碘值（g）
175~210
154~170
104~110
85~100
48~64
25~41
三、试剂和器材
1．试剂
（1）溴化碘溶液
取12.2g碘，放入1500mL锥形瓶内，缓慢加入1000mL冰乙酸（99.5%），边加边摇，同时略温热，使碘溶解。
冷却后，加溴约3mL。
注意：
所用冰乙酸不应含有还原性物质。
检查方法：
取2mL冰乙酸，加少许重铬酸钾及硫酸，若呈绿色，则证明有还原性物质存在。
（2）0.1mol/L标准硫代硫酸钠溶液
取结晶硫代硫酸钠50g，溶在经煮沸后冷却的蒸馏水（无CO2存在）中。
添加硼砂7.6g或氢氧化钠1.6g（硫代硫酸钠溶液在pH9～10时最稳定）。
稀释到2000ml后，用标准0.1mol/L碘酸钾溶液按下法标定：
准确量取0.1mol/L碘酸钾溶液20mL、10％碘化钾溶液10mL和1mol/L硫酸20mL，混合均匀。
以1％淀粉溶液作指示剂，用硫代硫酸钠溶液进行标定。
按下面所列反应式计算硫代硫酸钠溶液浓度后，用水稀释至0.1mol/L。
KIO3+5KI+3H2SO43K2SO4+3I2+3H2O
I2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6
（3）纯四氯化碳
（4）1％淀粉溶液（溶于饱和氯化钠溶液中）
（5）10％碘化钾溶液
（6）花生油或猪油
2．器材
（1）碘瓶（或带玻璃塞的锥形瓶）
（2）棕色、无色滴定管各1支
（3）吸量管
（4）量筒
（5）分析天平
四、操作步骤
1．准确称取0.3～0.4g花生油2份，置于两个干燥的碘瓶内，切勿使油粘在瓶颈或壁上。
加入10mL四氯化碳，轻轻摇动，使油全部溶解。
用滴定管仔细地加入25mL溴化碘溶液，勿使溶液接触瓶颈，塞好瓶塞，在玻璃塞与瓶口之间加数滴10％碘化钾溶液封闭缝隙，以免碘的挥发损失。
在20～30℃暗处放置30min，并不时轻轻摇动。
油吸收的碘量不应超过溴化碘溶液所含之碘量的一半，若瓶内混合物的颜色很浅，表示花生油用量过多，改称较少量花生油，重作。
2．放置30min后，立刻小心地打开玻璃塞，使塞旁碘化钾溶液流入瓶内，切勿丢失。
用新配制的10％碘化钾10mL和蒸馏水50mL把玻璃塞和瓶颈上的液体冲洗入瓶内，混匀。
用0.1mol／L硫代硫酸钠溶液迅速滴定至浅黄色。
加入1％淀粉溶液约1mL，继续滴定，将近终点时，用力振荡，使碘由四氯化碳全部进入水溶液内。
再滴定至蓝色消失为止，即达滴定终点。
另作2份空白对照，除不加油样品外，其余操作同上。
滴定后，将废液倒入废液缸内，以便回收四氯化碳。
计算碘值。
五、结果计算
碘值表示100g脂肪所能吸收碘的克数，因此样品碘值的计算如下：
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