志贺氏菌检测.docx

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志贺氏菌检测

1设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

1.1恒温培养箱：

36C±「C；

1.2冰箱：

2C〜5C；

1.3膜过滤系统；

1.4厌氧培养装置：

41.5C±1C；

1.5电子天平：

感量0.1g；

1.6显微镜：

10X〜100X；

1.7均质器；

1.8振荡器；

1.9无菌吸管：

1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头；

1.10无菌均质杯或无菌均质袋：

容量500ml；

1.11无菌培养皿：

直径90mm；

1.12pH计或pH比色管或精密pH试纸；

1.13全自动微生物生化鉴定系统。

2培养基和试剂

3.1志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：

见附录中1。

3.2麦康凯（MAC）琼脂：

见附录中2。

3.3木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：

见附录中3。

3.4三糖铁（TSI）琼脂：

见附录中4。

3.5营养琼脂斜面：

见附录中5。

3.6半固体琼脂：

见附录中6。

3.7葡萄糖铵培养基：

见附录中7。

3.8尿素琼脂：

见附录中8。

3.9B-半乳糖苷酶培养基：

见附录中9。

3.10氨基酸脱羧酶试验培养基：

见附录中10。

3.11糖发酵管：

见附录中11。

3.12西蒙氏柠檬酸盐培养基：

见附录中12。

3.13粘液酸盐培养基:

见附录中13。

3.14蛋白胨水、靛基质试剂：

见附录中14。

3.15志贺氏菌属诊断血清。

3.16生化鉴定试剂盒。

4操作步骤

4.1增菌

以无菌操作取检样25g（ml），加入装有灭菌225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000r/min〜10000r/min均质；或加入装有225ml志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1min〜2min，液体样品振荡混匀即可。

于415C±1C，厌氧培养16h〜20h。

4.2分离

取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于36C±1C培养20h〜24h，观察各个平板上生长的菌落形态。

宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。

若出现的菌落

不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察。

志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表1。

表1志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

选择性琼脂平板

志贺氏菌的菌落特征

MAC琼脂

无色至浅粉红色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或

戈不齐

XLD琼脂

粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不

、齐

4.3初步生化试验

4.3.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置36C±1C培养20h〜24h，分别观察结果。

4.3.2凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其4.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验和血

清学分型。

4.4生化试验及附加生化试验

441生化试验

用431中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即B-半乳

糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。

除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌13型的鸟氨酸阳性；宋内氏菌和痢疾志贺氏菌1型，鲍氏志贺氏菌13型的B-半乳糖苷酶为阳性以外，其余生化试验志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。

另外由于福氏志贺氏菌6型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似，必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。

生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属。

志贺氏菌属生化特性见表2。

表2志贺氏菌属四个群的生化特征

生化反应

A群：

痢疾志贺氏菌

B群：

福氏志贺氏菌

C群:

鲍氏志贺氏菌

D群：

宋内氏志贺氏菌

3-半乳糖苷酶

一

尿素

一

赖氨酸脱羧酶

一

鸟氨酸脱羧酶

一

水样苷

一

七叶苷

一

靛基质

—/+

（+）

一/+

一

甘露醇

一

棉子糖

一

甘油

（+）

一

（+）

注：

+表示阳性；

一表示阴性；一/+表示多数阴性；+/一表示多数阳性；（+）表示迟缓阳性；d表示有不

同生化型。

a痢疾志贺1型和鲍氏13型为阳性。

b鲍氏13型为鸟氨酸阳性。

c福氏4型和6型常见甘露醇阴性变种。

442附加生化实验

由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenicE.col）、A-D（Alkalescens-D

isparbiotypes碱性-异型）菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验（36C培养24h〜48h）。

志贺氏菌

属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别见表3。

表3志贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别

生化反应

A群：

痢疾

志贺氏菌

B群：

福氏

志贺氏菌

C群：

鲍氏

志贺氏菌

D群：

宋内氏

志贺氏菌

大肠埃希

氏菌

A-D菌

葡萄糖胺

一

西蒙氏柠檬酸盐

一

粘液酸盐

一

注1:

+表示阳性；一表示阴性；d表示有不冋生化型。

注2:

在葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺氏菌一般为阴性，而不活泼的大肠埃希氏菌、A-D（碱性-异型）菌至少有一项反应为阳性。

4.4.3如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据432的初步判断结果，用431中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

4.5血清学鉴定

4.5.1抗原的准备

志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。

志贺氏菌属主要有菌体（0）抗

原。

菌体0抗原又可分为型和群的特异性抗原。

一般采用1.2%〜1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

注1:

一些志贺氏菌如果因为K抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于1ml生理盐水做成浓菌液，100C煮沸15min〜60min去除K抗原后再检查。

注2:

D群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。

与肠杆菌科不同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。

宋内氏志贺氏菌没有K抗原。

4.5.2凝集反应

在玻片上划出2个约1cmx2cm的区域，挑取一环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。

再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。

将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑色背景进行观察，如果抗血清中出现凝结成块的颗粒，而且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。

如果生理盐水中出现凝集，视作为自凝。

这时，应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验。

如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性的话，则按4.5.1注1进行试验。

1志贺氏菌增菌汤-新生霉素（Shigellabroth）

1.1志贺氏菌增菌肉汤

1.1.1成分

胰蛋白胨

20.0g

葡萄糖

1.0g

磷酸氢二钾

2.0g

磷酸二氢钾

2.0g

氯化钠

5.0g

吐温80

1.5ml

蒸馏水

1000ml

7.0±0.2

1.1.2制法

将以上成分混合加热溶解，冷却至25C左右校正pH，分装适当的容器

火菌15min，取出后冷却至

50C〜55C，加入除菌过滤的新生霉素溶液（

g/ml），分装225ml备用。

注：

如不立即使用，在

2C〜8C条件下可储存一个月。

1.2新生霉素溶液

1.2.1成分

新生霉素

25.0mg

蒸馏水

1000ml

附录培养基和试剂

121C

0.5卩

用0.22卩m过滤膜除菌，如不立即使用，在2C〜8C

1.2.2制法将新生霉素溶解于蒸馏水中，条件下可储存一个月。

1.3临用时每225ml志贺氏菌增菌肉汤（1.1）加入5ml新生霉素溶液（1.2）,混匀

2麦康凯（MAC）琼脂

2.1成分

蛋白胨

20.0g

乳糖

10.0g

3号胆盐

1.5g

氯化钠

5.0g

中性红

0.03g

结晶紫

0.001g

琼脂

15.0g

蒸馏水

1000ml

7.2±0.2

2.2制法

将以上成分混合加热溶解，冷却至25r左右校正pH，分装，121C高压灭菌15min。

冷却至45C〜50C,倾注平板。

注：

如不立即使用，在2C〜8C条件下可储存二周。

3木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂

3.1成分

酵母膏

3.0g

L-赖氨酸

5.0g

木糖

3.75g

乳糖

7.5g

蔗糖

7.5g

脱氧胆酸钠

1.0g

氯化钠

5.0g

硫代硫酸钠

6.8g

柠檬酸铁铵

0.8g

酚红

0.08g

琼脂

15.0g

pH7.4±0.2

3.2制法

除酚红和琼脂外，将其他成分加入400ml蒸馏水中，煮沸溶解，校正pH。

另将琼脂加入600ml蒸馏水中，煮沸溶解。

将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至50C〜55C倾注平皿。

注：

本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。

本培养基宜于当天制备，第二天使用。

使用前必须去除平板表面上的水珠，在37C〜55C温度下，琼脂面向下、平板盖亦向下烘干。

另外如配置好的培养基不立即使用，在2C〜8C条件下可储存二周。

4三塘铁（TSI）琼脂

4.1成分

蛋白胨

20.0g

牛肉浸膏

5.0g

乳糖

10.0g

蔗糖

10.0g

葡萄糖

1.0g

硫酸亚铁铵（NH4）2Fe（SO4）•6H2O

0.2g

氯化钠

5.0g

硫代硫酸钠

0.2g

酚红

0.025g

琼脂

12.0g

蒸馏水

1000ml

7.4±0.2

4.2制法

除酚红和琼脂外，将其他成分加于400ml蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min,加热使完全溶化，冷却至25E左右校正pH至7.4±0.2。

另将琼脂加于600ml蒸馏水中，静置约10min，加热使完全溶化。

将两溶液混合均匀，加入5%酚红水溶液

5ml，混匀，分装小号试管，每管约3ml。

于121C灭菌15min，制成高层斜面

冷却后呈桔红色。

如不立即使用，在2C〜8C条件下可储存一个月

5营养琼脂斜面

5.1成分

蛋白胨

10.0g

牛肉膏

3.0g

氯化钠

5.0g

琼脂

15.0g

蒸馏水

1000ml

7.0±0.2

5.2制法

将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2ml，冷

却至25C左右校正pH至7.0土0.2。

加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。

分装小号试管，每管约3ml。

于121C灭菌15min，制成斜面。

注：

如不立即使用，在2C〜8C条件下可储存二周。

6半固体琼脂

6.1成分

蛋白胨1.0g

牛肉膏0.3g

氯化钠0.5g

琼脂0.3g〜0.7g

蒸馏水100ml

pH7.4±0.2

6.2制法

按以上成分配好，加热溶解，校正pH，分装小试管，121C灭菌15min，直立凝固备用。

7葡萄糖胺培养基

7.1成分

氯化钠

5.0g

硫酸镁（MgSO4•7H2O）

0.2g

磷酸二氢铵

1.0g

磷酸氢二钾

1.0g

葡萄弹

2.0g

琼脂

20.0g

0.2%溴麝香草酚蓝水溶液

40.0ml

蒸馏水

1000ml

6.8±0.2

7.2制法

先将盐类和糖溶解于水内，校正pH，再加入琼脂加热溶解，然后加入指示

剂。

混合均匀后分装试管，

121C高压灭菌15min。

制成斜面备用。

8尿素琼脂

8.1成分

蛋白胨

1.0g

氯化钠

5.0g

葡萄糖

1.0g

磷酸二氢钾

2.0g

0.4%酚红溶液

3.0ml

琼脂

20.0g

20%尿素溶液

100.0ml

蒸馏水

1000ml

7.2±0.2

将上述成分加入蒸馏水中，

煮沸溶解，调节pH，分装小试管，121C高压灭菌15min

8.2制法

除酚红和尿素外的其他成分加热溶解，冷却至25C左右校正pH，加入酚红指示剂，混匀，于121T灭菌15min。

冷至约55C，加入用0.22卩m过滤膜除菌后的20%尿素水溶液100ml,混匀，以无菌操作分装灭菌试管，每管约3ml〜4ml,制成斜面后放冰箱备用。

8.3试验方法

挑取琼脂培养物接种，在36C±C培养24h,观察结果。

尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。

9B-半乳糖苷酶培养基

9.1液体法（ONPG法）

9.1.1成分

邻硝基苯B-D-半乳糖苷（ONPG）60.0mg

0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5土0.2）10.0ml

1%蛋白胨水（pH7.5±0.2）30.0ml

9.1.2制法

将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装于10mmx75mm试管内，每管0.5ml，用橡皮塞塞紧。

9.1.3试验方法

自琼脂斜面挑取培养物一满环接种，于36E±C培养1h〜3h和24h观察结果。

如B-D-半乳糖苷酶产生，则于1h〜3h变黄色，如无此酶则24h不变色。

9.2平板法（X-Gal法）

9.2.1成分

蛋白胨20.0g

氯化钠3.0g

5-溴4氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷（X-Gal）200.0mg

琼脂15.0g

蒸馏水1000ml

pH7.2±0.2

9.2.2制法

将各成分加热煮沸于1L水中，冷却至25E左右校正pH，115E高压灭菌

10min。

倾注平板避光冷藏备用。

9.2.3试验方法

挑取琼脂斜面培养物接种于平板，划线和点种均可，于36C±1C培养18h〜

24h观察结果。

如果B-D-半乳糖苷酶产生，则平板上培养物颜色变蓝色，如无此酶则培养物为无色或不透明色，培养48h〜72h后有部分转为淡粉红色。

10氨基酸脱羧酶试验培养基

10.1成分

蛋白胨

酵母浸膏

葡萄糖

1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液

L型或DL型赖氨酸和鸟氨酸

蒸馏水pH

10.2制法

5.0g

3.0g

1.0g

1.0ml

0.5g/100ml或1.0g/100ml

1000ml

6.8±0.2

除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100ml，分别加入赖氨酸和鸟氨酸。

L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入，再校正pH至6.8±0.2。

对照培养基不加氨基酸。

分装于灭菌的小试管内，每管0.5ml，上面滴加一层石蜡油，115°C高压灭菌10min。

10.3试验方法

从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36C±1C培养18h〜24h，观察结果。

氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。

阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。

阴性对照管应为黄色，空白对照管为紫色。

11糖发酵管

11.1成分

5.0g

10.0g

3.0g

牛肉膏

蛋白胨

氯化钠

磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）

0.2%溴麝香草酚蓝溶液

2.0g

12.0ml

蒸馏水

1000ml

11.2制法

7.4±0.2

11.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，25C左右校正pH,

分装于有一个倒置小管的小试管内，121°C高压灭菌15min。

11.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100ml,121C高压灭菌15min。

另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。

将5ml糖溶液加入于100ml培养基内，以无菌操作分装小试管。

注：

蔗糖不纯,加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。

11.3试验方法

从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36C±C培养，一般2d〜3d。

迟缓反

应需观察14d〜30d。

12西蒙氏柠檬酸盐培养基

12.1成分

氯化钠

5.0g

硫酸镁（MgSO4•7H2O）

0.2g

磷酸二氢铵

1.0g

磷酸氢二钾

1.0g

柠檬酸钠

5.0g

琼脂

20g

0.2%溴麝香草酚蓝溶液

40.0ml

蒸馏水

1000ml

6.8±0.2

12.2制法

先将盐类溶解于水内，调至pH，加入琼脂，加热溶化。

然后加入指示剂,

混合均匀后分装试管，121C灭菌15min。

制成斜面备用

12.3试验方法

挑取少量琼脂培养物接种，于36C±1C培养4d,每天观察结果。

阳性者斜

面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。

13粘液酸盐培养基

13.1测试肉汤

13.1.1成分

酪蛋白胨

10.0g

溴麝香草酚蓝溶液

0.024g

蒸馏水

1000ml

粘液酸

10.0g

7.4±0.2

13.1.2制法

慢慢加入5N氢氧化钠以溶解粘液酸，混匀。

其余成分加热溶解，加入上述

粘液酸，冷却至25C左右校正pH至，分装试管，每管约5ml，于121C高压灭菌10min。

13.2质控肉汤

13.2.1成分

酪蛋白胨10.0g

溴麝香草酚蓝溶液0.024g

蒸馏水1000ml

pH7.4±0.2

13.2.2制法

所有成分加热溶解，冷却至25C左右校正pH，分装试管，每管约5ml，于

121C高压灭菌10min。

13.3试验方法

将待测新鲜培养物接种测试肉汤和质控肉汤，于36C±1C培养48h观察结果，肉汤颜色蓝色不变则为阴性结果，黄色或稻草黄色为阳性结果。

14蛋白胨水、靛基质试剂

14.1成分

蛋白胨（或胰蛋白胨）

20.0g

氯化钠

5.0g

蒸馏水

1000mL

7.4

14.2制法

按上述成分配制，分装小试管，121C高压灭菌15min。

注：

此试剂在2C〜8C条件下可储存一个月。

14.3靛基质试剂

14.3.1柯凡克试剂：

将5gX寸二甲氨基苯甲醛溶解于75ml戊醇中。

然后缓慢加入浓盐酸25ml。

14.3.2欧—波试剂：

将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95ml95%乙醇内。

然后缓慢加入浓盐酸20ml。

14.4试验方法

挑取少量培养物接种，在36C±1C培养1d〜2d,必要时可培养4d〜5d。

加入柯凡克试剂约0.5ml，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧-波试剂约0.5ml，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

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