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2007年博士生研究生入学考试
试题名称：
分子病毒学
一名词解释
1CPE：
细胞病变效应：
病毒感染导致的细胞损伤。
可在光学显微镜观察，表现形式因病毒与细胞的种类而异，有多种形式如细胞圆缩、肿大、形成合胞体或空泡等。
通常用CPE作为指标，来判定病毒的毒力，即计算病毒的TCID50。
2Inclusionbody：
包涵体：
细胞在感染病毒以后，出现于细胞浆和细胞核内的特殊结构，染色后可在光学显微镜下见到，且在不同的病毒感染中往往具有各自独特的形态、染色特性和存在部位，例如是单个还是多个的，是圆形还是不规则形的，是嗜酸性着染还是嗜碱性，是在核内还是胞浆内等等。
（可以看作为病毒核酸和病毒蛋白质在细胞内集中合成及装配成病毒粒子的场所,或者是病毒粒子发生的部位（病毒工厂））。
补：
包埋体：
occlusionbody专指含有病毒颗粒蛋白质结晶结构，是包涵体的一种特殊形式，见于病毒感染的昆虫及甲壳动物细胞。
3Reversegenetics反向遗传学是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰（如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等）,再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状的影响等方面的内容。
与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。
反向遗传操作技术：
反向遗传操作技术是指通过构建RNA病毒的感染分子克隆,在病毒cDNA分子水平上对其进行体外人工操作,如进行基因点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造,以此来研究RNA病毒的基因复制与表达调控机理、RNA编辑和自发重组与诱导重组、病毒与宿主间的相互作用关系、抗病毒策略、基因治疗研究,以及构建新型病毒载体来表达外源基因和进行疫苗的研制等
4PrP朊病毒蛋白：
PrPc是正常细胞的一种糖蛋白，PrPc构象发生变化形成其同源异构体PrPsc，PrPsc是朊病毒的基本单位，PrPs可凝聚成电镜下可见的SAF痒病相关纤维。
蛋白酶K有抵抗性。
补：
SAF痒病相关纤维，是在电镜下于传染性海绵状脑病的动物组织切片中发现的一种大分子纤维状物，由PrPSC分子组成，具有一定的特异性，可作为各种海绵状脑病的病理学诊断指标。
（发现于感染痒疫的脑组织内。
它是PrPSC凝聚形成的直径约4-6nm的螺旋形杆状纤维。
可在脑组织内形成神经元空斑。
）
5Earlytranscription早期转录在病毒感染过程中，一般在病毒基因复制之前，早期基因进行的转录，其产物为早期蛋白。
一般是病毒增殖所必需的酶类或者是对晚期转录的调节蛋白。
7Matrixprotein基质蛋白在病毒学中是一种连接病毒囊膜与病毒核心的结构蛋白。
在维持病毒形态、病毒装配过程中起到一定作用如流感病毒的M1蛋白。
8Virino朊病毒：
朊病毒是一种不含有核酸的传染性蛋白质颗粒，能通过分子自身构象变化，并传到其他分子引起同样的变化而致病，是传染性海绵状脑病的病原。
Virion病毒体：
成熟的病毒颗粒，由蛋白质外壳包裹着单分子的核酸构成、形态学上完整的病毒颗粒。
6Viriod类病毒：
具有共价闭合环状结构的单链RNA，分子量很小，没有蛋白质，具有感染性，多与植物疾病有关。
10、Pseudo-typevirus:
假型病毒，两种病毒混合感染产生的病毒，一种病毒的外壳包装着另一种病毒的核酸。
9Monoclonalantibody：
单克隆抗体，是指由一个B细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原决定簇的抗体。
是根据体外淋巴细胞瘤技术产生的。
流式细胞术
10、流式细胞术（FlowCytoMeter，flowcytometryassay，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。
二简答题
1病毒对细胞损害的主要形式
1.细胞死亡病毒引起的细胞死亡，原因比较复杂。
既有病毒粒子或病毒物质的直接的理化学障碍或毒性作用，又有细胞发生病变后的自身性继发作用。
病毒还可以抑制宿主细胞的蛋白合成，细胞被抑制后没有足够的酶类用于自身DNA的合成,很多RNA和DNA病毒感染细胞后,都会对宿主细胞DNA的合成产生抑制。
病毒物质的直接毒性作用，已在许多病毒得到证实。
2.包涵体在某种意义上说，包涵体是某些病毒对一定的机体或细胞的病理学特征。
这种特征具有一定程度的种属（型）性，例如疱疹病毒引起核内嗜酸性包涵体，痘病毒则引起胞浆内嗜酸包涵体，而且两者可在离体的组织培养细胞内引起与自然发病动物组织中同样的包涵体。
3.细胞融合发现于结核病灶内的朗罕细胞，就是一种因结核菌感染而发生的多核巨细胞。
在鼻疽、麻风、百日咳、球孢子虫病、放线菌病以及新城疫、麻疹、犬瘟热、牛瘟、牛痘和疱疹乃至维生素缺乏等许多疾病中，也都有过发现这类多核巨细胞的报道。
细胞融合现象，显然对细胞的生命活动呈现损害作用，因为融合细胞大多丧失功能，并且最后死亡。
在动物体内，细胞融合可能也是病毒感染过程中发生病变的原因之一。
4.红细胞凝集正粘病毒和许多副粘病毒具有凝集动物红细胞的作用。
这是因为这些病毒的囊膜突起—血凝素（糖蛋白）与红细胞表面的粘蛋白受体发生结合，结果形成红细胞－病毒－红细胞复合体，表现为红细胞凝集。
于电子显微镜下，可以清楚地看到病毒粒子的穗状突起对红细胞表面的附着现象。
5.细胞恶性变，又称细胞转化。
如前述，某些致瘤病毒有使细胞发生恶性变的能力。
这类病毒在试管内诱发恶性变细胞，并可能在动物体内引起肿瘤。
6.感染动物体内的细胞损伤不同类型和不同部位的细胞损伤，对机体的危害性也不一样。
皮肤细胞发生损伤时，机体的正常生命活动一般不受明显影响；粘膜细胞的损伤，则常引起比较严重的消化道或呼吸道症状；小血管内皮细胞的损伤，更可招致水肿、出血、梗塞和缺氧等严重病变。
而脑细胞和心肌细胞的损伤，则常带来致命性的后果。
如前所述，机体内的细胞损伤与试管内培养细胞的细胞损伤有所不同，除病毒直接引起者外，还可能是免疫反应的结果，例如由抗原－抗体复合物或细胞免疫所致的细胞损伤或细胞死亡等。
2、体液免疫过程
免疫应答基本过程
免疫应答过程包括：
①免疫细胞对抗原分子的识别过程，即抗原分子与免疫细胞间的相互作用。
②免疫细胞的活化、增殖和分化过程，即免疫细胞间的相互作用。
③效应分子和效应细胞的排异作用。
因此，为了描述方便，免疫应答的全过程人为地将其划分为相应的三个阶段，即感应段阶、活化增殖和分化阶段以及效应阶段。
一、感应阶段
感应阶段包括抗原在体内的分布、定位，抗原递呈细胞对抗原的摄取、加工和递呈以及抗原特异性淋巴细胞对抗原的识别。
（一）抗原在体内的分布和定位
进人体内的抗原几分钟内，即可经血管和淋巴管迅速地运行到全身，其中绝大部分被吞噬细胞分解清除，只有少部分存留于淋巴组织中诱导免疫应答。
淋巴结中的抗原在两个主要区域被抗原递呈细胞捕获。
一是在深皮质区（即胸腺依赖区）和淋巴窦壁被巨噬细胞或树突状细胞捕获。
二是在浅皮质区淋巴滤泡内。
在脾脏中，抗原从边缘区通过边缘窦而入白髓，并在淋巴滤泡中被长期存留，这是脾脏中抗原存留的主要部位。
（二）抗原的加工和递呈
通常，外源性蛋白质抗原由抗原递呈细胞（如巨噬细胞）加工和MHC—Ⅱ类分子结合，递呈给CD4+TH细胞；内源性蛋白质抗原由靶细胞处理和MHC—Ⅰ类分子结合，递呈给CD8+TC细胞。
（三）抗原特异性淋巴细胞对抗原的识别
机体免疫系统对抗原的识别，主要由T细胞和B细胞完成。
识别途径和机制各有其特点。
1．T细胞对抗原的识别T细胞只识别由APC提交的蛋白质抗原，亦即T细胞是以表面抗原受体TCR识别自身MHC分子与抗原肽相结合成的复合体，此为双识别作用。
有以下3种主要的识别途径。
（1）外源性抗原被AK以胞吞形式摄取，在吞噬溶酶体中醇解成抗原肽并和MHC—Ⅱ类分子结合，表达于细胞表面后为TH细胞所识别。
（2）内源性抗原直接在APC（包括靶细胞）胞浆内被蛋白酶体相关结构酶解成抗原肽，进入内质网腔和MHC-Ⅰ类分子结合后表达于细胞表面，为TC/TS细胞所识别。
（3）超抗原直接与T细胞抗原识别受体β链及APC表面Ⅱ类分子结合，被TH细胞识别。
2．B细胞对抗原的识别B细胞以表面抗原受体BCR即免疫球蛋白分子识别抗原。
后者分为依赖胸腺的抗原（TDAg）和不依赖胸腺的抗原（TIAg）两大类，主要取决于识别过程中有无胸腺衍生的TH细胞参与。
B细胞对抗原的识别也有3种形式。
（1）对TI-Ⅰ型抗原的识别此类抗原在高浓度时与丝裂原受体结合，可激活几乎所有B细胞，是B细胞的多克隆激活剂。
低浓度时，TI—Ⅰ型抗原无多克隆激活作用，但可被B细胞表面抗原受体所识别而激活B细胞。
（2）对TI—2型抗原的识别这是一类决定簇高度重复的直线抗原，在体内不易被降解，能较长期地持续吸附于巨噬细胞表面，并能与具有高亲和力的特异性B细胞抗原受体交联，形成“帽状”，进而触发活化信号，使B细胞活化。
通常只能激活B细胞，分化产生IgM。
（3）对TD抗原的识别B细胞对TD抗原的处理递呈方式与巨噬细胞对外源性抗原的加工递呈十分相似。
主要区别在于：
①以胞吞形式进入B细胞吞噬溶酶体的抗原（或半抗原—载体）分子，必须是被B细胞抗原受体即SmIg专一性识别的抗原，以保证B细胞激活后最终产生的抗体能与相应抗原（或半抗原）发生专一性结合。
然而巨噬细胞对外源性抗原的摄取和胞吞，并无特异性。
②B细胞用以激活TH细胞的抗原浓度很低（1～100μg/L），仅为巨噬细胞所需抗原浓度的104～106分之一。
B细胞SmIg和抗原间亲和力高，增加了激活TH的效率和专一性。
二、增殖和分化阶段
此阶段包括抗原特异性淋巴细胞识别抗原后的活化、增殖与分化过程。
T淋巴细胞增生分化为淋巴母细胞，最终成为效应淋巴细胞；B细胞增殖分化为浆细胞，合成和分泌抗体；部分T．B细胞中途分化为记忆细胞（Tm和Bm）。
此阶段涉及多种细胞间的协作和多种细胞因子的参与。
一、T细胞的活化、增殖与分化
静止的TH细胞（G0期）在识别APC递呈的抗原后，细胞表面表达白介素—1受体（IL—1R），成为诱导性T细胞（Tinducer,Ti），并接受巨噬细胞产生的IL-1信号而活化，继之表达白介素-2受体（IL-2R），成为活化的TH细胞。
当IL-2R与IL—2（自分泌或旁分泌的）相结合，T细胞即母细胞化，表现为胞体变大，胞浆增多，染色质疏松，出现明显的核仁、微管和多聚核糖体形成，大分子物质合成与分泌增加，并增殖、分化成效应性TH细胞，分泌一系列细胞因子，包括IL-2．IL-4．IL-5．IL—6．IL—9以及IFN—γ等，进而发挥TH细胞的辅助效应（图9—8）。
细胞因子中最重要的是IL—2，它是促进T细胞（包括各亚群）增殖分化的重要介质。
当活化TH细胞（G1期）上的IL-2R与IL-2结合即进入S期（DNA合成期），在此期细胞DNA成倍增加。
TH细胞经过一个较短的DNA合成后期（G2期），即进入有丝分裂期（M期）。
随着新分裂的TH细胞的继续增殖，产生更多的IL-2，作用于TH细胞及其他亚群，使T细胞不断增殖、分化和成熟。
其中一部分细胞中途停止增殖，成为记忆性T细胞（Tmemory cell，Tm）。
（二）、B细胞的活化、增殖和分化
1．TI抗原对B细胞的激活TI抗原可单独激活B细胞。
高浓度TI-1型抗原多克隆激活作用不通过B细胞SmIg，作用机制尚不清楚。
TI—2型抗原可藉助与SmIg受体交联使B细胞活化，其机制是启动Ig介导的信号转送途径。
2．TD抗原对B细胞的激活TD抗原对B细胞的激活需要CD4+TH细胞的积极参与，具有双信号特点。
三、效应阶段
此阶段主要包括激活的效应细胞和效应分子（抗体和细胞因子等）产生体液免疫和细胞免疫效应的过程。
B细胞介导的体液免疫
B细胞介导的体液免疫应答可由TI抗原或TD抗原诱发,体液免疫应答除包括上述三个阶段外，尚有其自身的特点。
一、体液免疫应答的类型和特点
体液免疫应答的类型与刺激抗原的类型有关。
（一）TI抗原引起的免疫应答
这类应答不需TH细胞辅助，绝大多数也不需要巨噬细胞参与，只产生IgM型抗体，无免疫记忆。
但由于TI抗原在体内代谢很慢，可较长时间地刺激机体而使机体应答过程延长。
（二）TD抗原引起的免疫应答
这类应答需要巨噬细胞和T细胞的协作，先产生IgM，继之产生IgG或其他类型Ig。
初次刺激后可诱导记忆性B细胞形成，相同抗原再次刺激可出现二次抗体应答（回忆应答）。
3研究遗传变异主要内容
研究病毒的遗传变异，包括几方面的内容：
从整体水平上研究病毒的突变率，即某病毒基因组一次复制过程中某一核苷酸位点因置换、缺失或插入而改变的可能性；根据某一遗传学指标（见上述），从自然流行毒株中筛选或结合应用诱变因素筛选有意义的变异株；分析变异株突变的性质；通过人工突变研究某一位点（或区域）的改变对病毒遗传性状的影响。
（1）病毒突变率研究：
确定病毒突变率的方法有多种。
首先，最直接的方法是体外测定病毒基因组复制酶的错配率。
其次，病毒突变率可根据由一个纯化克隆衍生而来的病毒基因组群体中核苷酸置换的频率估计出来；或者由同一蚀斑衍生而来的大量病毒克隆的直接序列分析测定出来，
（2）人工筛选变异株：
在动物病毒变异研究中最具有实际意义的是获得毒力低，而仍保持动物病毒许多毒力变异株是人工培育的结果，概括起来有以下几种减毒方法①异种动物适应性变异:
③鸡胚适应性变异:
②异常感染途径适应性变异:
④细胞适应性变异:
⑥重组试验:
⑤ts-变异株和低温适应株的培育
（3）突变性质的分析：
即首先筛选获得具有特定表现型的变异株，然后分析野生型和变异型之间的基因组序列差异。
（4）人工突变：
重组DNA技术使得有可能将传统的方法颠倒过来，首先在克隆的病毒DNA（或cDNA）上通过化学或酶学方法产生人工突变，然后研究其对相关表型的影响。
这种方法可产生几乎100%的突变率，且基本上可得到所有可能的突变。
将突变导入克隆病毒DNA的方法概括起来有三类：
碱基置换；缺失或插入；成簇碱基（或短序列）置换。
4禽流感对动物机体的致病机理大体思路：
1流感病毒首先损害动物机体的呼吸系统：
在动物的鼻腔、气管支气管等的呼吸道上皮细胞中复制，导致其变性和坏死。
最终导致严重的呼吸道损害。
不同毒株能引起的损害程度不同。
2可以损害免疫系统：
白细胞大量减少，淋巴细胞减少诱导脾脏和肺组织的细胞凋亡，导致淋巴造血系统的改变。
损害抗原递呈细胞，引起免疫功能失调。
引起不同程度的免疫抑制，继发感染化脓性链球菌等，死亡率升高。
引起机体的多种变态反应，炎性因子风暴。
3还可以侵害神经系统。
有些高致病力毒株感染小鼠后在脑、三叉神经和迷走神经的神经结内可检测出。
目前为广大学者接受的致病机理主要有如下几种：
1流感病毒诱导宿主细胞产生凋亡是其致细胞病变的重要机理之一
2病毒感染后对细胞造成的氧化应激损伤也是学者普遍接受的致病机理
3细胞因子风暴学说等其他学术学说和理论以上3种机制相互联系并且均与凋亡密切相关（综述文章）
禽流感的致病机理（网上搜的）
1、对动物的致病机理
当流感病毒与宿主细胞结合后，会诱导病毒囊膜与细胞膜结合，使病毒粒子进入细胞。
病毒要具有侵染性，必须经过两个过程：
①宿主蛋白酶将HA裂解为HA1和HA2；②裂解后的HA2暴露出疏水区并与宿主细胞膜脂双层相互结合。
禽流感病毒HA裂解为HA1和HA2是其致病的重要因素，在病毒入侵细胞及决定病毒致病力方面起着关键作用。
低致病力禽流感病毒在HA裂解位点上只有一个或两个碱性氨基酸——精氨酸，这种结构只能被存在于呼吸道和消化道内的精氨酸特异蛋白酶识别并裂解，因此，低致病力禽流感病毒感染一般只在呼吸道和消化道内局部繁殖。
而高致病力禽流感病毒在HA裂解位点具有多个碱性氨基酸，可被机体大多数组织细胞内的蛋白酶识别并裂解，具有广泛的嗜细胞性，所以一旦高致病力禽流感病毒进入机体就会迅速全身扩散，导致全身多个组织发病并死亡。
总之，HA碱性氨基酸的多少和宿主体内蛋白裂解酶的分布是决定病毒致病能力及其在机体内扩散能力的主要因素。
高致病性人禽流感病毒致病机制的分子基础
禽流感病毒属正粘病毒科，A型流感病毒属。
该病毒的基因组分为8个节段、负链的RNA片段，编码11种蛋白，即聚合酶蛋白PB2、PB1和PA，血凝素HA、核蛋白NP、神经氨酸酶NA、M基因编码的基质蛋白M1和离子通道M2、NS基因编码的非结构蛋白NS1和NS2以及新发现的与诱导细胞凋亡有关的PB1-F2蛋白。
禽流感病毒跨越种属屏障从家禽直接感染人与其基因的分子结构的特殊性有关。
2.1 血凝素结合位点的突变导致禽流感病毒易于感染人类细胞
血凝素（HA）是流感病毒表面主要的糖蛋白，病毒借助HA对宿主细胞表面受体的吸附作用而吸附于被感染细胞的表面，因此在病毒感染过程中起关键作用。
研究发现，禽流感病毒与宿主结合的特异性与ＨＡ受体结合位点的第226位氨基酸密切相关，如果该位点氨基酸残基为谷氨酰胺，则为SAa2,3Gal受体（禽类呼吸道上皮细胞表面的受体）结合特性；但若该位点为亮氨酸则为SAa2,6Gal受体（人呼吸道上皮细胞表面的受体）结合特异性，若为Met则同时对SAa2,3Gal和SAa2,6Gal具有相同的结合能力。
研究表明1997年香港禽流感H5N1病毒正是由于第226位氨基酸由谷氨酰胺突变为Ｍet，使其ＨＡ结合的受体发生变异，导致流感病毒的宿主特异性改变，使禽流感病毒直接感染人。
另外，：
高致病力毒株的HA在裂解位点附近有多个碱性氨基酸，因此病毒在感染过程中该位点易被蛋白酶系统裂解为HA1和HA2，使其对禽类致病性明显增强。
在人禽流感H5、H7亚型毒株中ＨＡ的裂解位点附近也存在有多个碱性氨基酸基序，但是该基序在其对人的致病性是否发挥的作用尚未阐明[3]。
2.2 PB2基因位点的突变导致人禽流感病毒增殖能力的增强
禽流感病毒感染人体细胞后必须进行有效复制，产生大量的病毒粒子，进而诱发机体的非特异性免疫反应，产生对机体的直接或间接的损伤作用，而禽流感病毒是否可以在人的体细胞内进行有效复制，主要是与病毒的聚合酶（ＰＢ1、ＰＢ2和ＰＡ）有关，尤其ＰＢ2的组成起决定性的作用。
通过反向遗传学已经证明PB2的627位氨基酸是决定A型流感病毒宿主范围的关键位点，而PB2的701位点对AIV的跨种传播具有重要意义。
2.3 非结构蛋白NS的突变导致人禽流感病毒致病能力显著增强
人禽流感H5N1病毒感染后与普通的人流感病毒相比具有极强的致病性。
目前研究表明人禽流感H5N1亚型病毒的高致病性与其非结构蛋白有关。
普通流感病毒感染时，非结构蛋白（NS1）产生于机体受感染的细胞，与病毒复制产生的双股RNA（dsRNA）相互作用启动干扰素的转录和合成，从而发挥抗病毒的非特异性免疫作用。
然而在高致病性的人禽流感H5N1亚型病毒感染者内却存在高浓度的干扰素和肿瘤坏死因子，但是这些细胞因子却不能抑制或杀死这种高致病性的人禽流感病毒。
研究表明这种病毒不仅对干扰素和肿瘤坏死因子具有极强的抵抗力，而且可以大量的增殖，进一步诱导炎性细胞因子的产生，引起全身性炎症反应综合征，从而在感染人的过程中表现出极高致病力。
分子生物学研究证明这种致病力与人禽流感H5N1病毒的非结构蛋白密切相关。
H5N1亚型病毒的非结构基因发生变异，与其第92位存在有谷氨酸有关。
由于NS192位氨基酸的变异，人禽流感H5N1病毒不仅可以逃避干扰素等细胞因子的抑制作用，反而通过诱导高水平的干扰素和肿瘤坏死因子对机体产生免疫损伤作用，从而产生更强的致病力。
另外，研究表明高致病性的人禽流感H5N1病毒非结构蛋白的结构域诱导机体淋巴细胞凋亡，
三论述题
1论述一个动物病毒载体的结构和功能，以及优缺点。
（伪狂犬童209）（腺病毒童223刘312）（NDV刘180）
腺病毒载体：
它是无囊膜的二十面体颗粒线状双链DNA病毒,腺病毒基因组长约36kb，有编码区和非编码区两部分。
在编码区，根据病毒DNA复制周期的不同分为早期基因区和晚期基因区，前者有E1-E4区，主要编码病毒的调节蛋白及功能蛋白，后者分为L1-L55个区，编码病毒的结构蛋白。
早期表达的调节蛋白可以调控晚期基因的表达，早期转录包括E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4。
在非编码区，腺病毒基因组两侧各有1个100bp～160bp的反向末端重复序列（ITR），左侧19～350bp为病毒包装信号Ψ。
E1区基因表达产物分为E1A和E1B,E1A蛋白的主要功能是调节细胞代谢,为病毒复制创造有利环境。
E1B蛋白结合p53、Bak和Bax蛋白。
E2区基因表达产物可分为E2A和E2B,E2A为DNA结合蛋白;E2B主要产物有两种,分别是末端蛋白前体和病毒DNA聚合酶,3种蛋白与至少3种细胞因子相互作用,启动AdDNA复制及病毒晚期基因的转录和翻译。
E3区基因表达产物功能与病毒基因组的复制无关,主要是破坏宿主的免疫防御机制。
E4区基因表达产物与病毒信使RNA的代谢有关,还有促进病毒DNA复制及关闭宿主蛋白合成的功能。
一些E4产物可以与DNA激活的蛋白激酶结合,防止病毒DNA发生串联。
该激酶可激活p53基因,因此认为E4区基因产物可以抑制细胞凋亡。
晚期基因在主要晚期启动子作用下转录为长前体转录物以及编码衣壳结构蛋白
腺病毒载体的构建
㈡腺病毒载体的构建方法：
E1区位病毒复制必需区，它的缺失使腺病毒载体称为复制缺陷型载体。
E3区时病毒复制非必需区，可用于外源基因的插入。
腺病毒载体常见的构建方法如下：
将启动子基因-外源基因-polyA盒插入到E1缺失区，就构建成穿梭质粒载体；再将E3区缺失的腺病毒DNA末端连成环状，内有细菌质粒的复制原片段，该环状腺病毒DNA可以在细菌内复制，但不会被包装成病毒体。
载有外源目的基因的穿梭质粒与环状病毒质粒共转染293细胞，通过同源重组可以产生一个E1区缺失的带外源基因的腺病毒重组体，而293细胞是一株人源胚肾细胞，它是由腺病毒左末端片段整合到人胚肾细胞培养而成，可以持久地分泌产生腺病毒E1蛋白，激活同源重组体产生包装蛋白，通过反式互补即可产生复制缺陷的重组腺病毒。
应用的方法包括：
体外连接法、细胞内同源重组、细菌内同源重组、位点特异性重组系统。
3腺病毒载体的优缺点
腺病毒载体的优点
作为基因转移工具，腺病毒载体与其他病毒载体相比，具有许多独特的优点：
①易于用重组DNA技术进行操作，腺病毒粒子相对稳定，就目前常用载体的血清型而言，病毒基因组重排频率低，外源基因片段插入片段在病毒连续复制几个周期后一般仍保持不变；②安全性较好，腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小，基因毒性低。
③腺病毒基因组较大（36kb），插入大片段外源性基因的潜力大；④宿主细胞较为广泛，除了可在肠道和呼吸道繁殖以外，还可以感染肝细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞和神经胶质细胞等多种人体细胞；⑤腺病毒容易制备，对热不敏感。
⑥腺病毒载体表达效率高，⑦腺病毒载体应用方便，腺病毒可经多种途径传播，给疫苗接种带来方便。
⑧腺病毒表达的蛋白具有天然蛋白的功能，可作为诊断抗原或免疫抗原用。
腺病毒载体的缺点（局限性）：
⑴腺病毒载体外源基因的容量较小。
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