两种氟喹诺酮类药物对肺炎克雷伯菌防耐药突变浓度及耐药突变体耐药性的研究.docx
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两种氟喹诺酮类药物对肺炎克雷伯菌防耐药突变浓度及耐药突变体耐药性的研究
两种氟喹诺酮类药物对肺炎克雷伯菌防耐药突变浓度及耐药突变体耐药性的研究
（作者:
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作者：
邓晓慧郑风劲何文富孙爱慧刘小康【摘要】目的测定两种氟喹诺酮类药物（FQNs）对肺炎克雷伯菌（KP）的防耐药突变浓度（MPC），比较其防耐药突变能力，了解突变耐药菌对FQNs的耐药性。
方法肉汤法富集1010CFU/ml的菌液接种于不同浓度环丙沙星及加替沙星琼脂平皿上，采用琼脂二倍稀释法测定环丙沙星、加替沙星对临床分离肺炎克雷伯菌ATCC700603及其耐药突变体的最低抑菌浓度（MIC）、防耐药突变浓度（MPC）。
对不同药物浓度筛选出的耐药突变株进行编码拓扑异构酶VIC亚单位基因parC和回旋酶A亚单位基因gyrA喹诺酮耐药决定区的PCR扩增和测序，并测定外排泵抑制剂羟基氰氯苯腙（CarbonylCyanidemchlorophenylhydrazone，CCCP）对环丙沙星和加替沙星MIC的影响。
结果环丙沙星、加替沙星对ATCC700603的MPC分别为4、1.6mg/L，细菌耐药选择指数分别为16、4。
两种药物的耐药突变体均出现了gyrA的第83位（TCC→ATC/TTG）均出现了突变，引起了相应氨基酸的改变（Ser83→Ile/Leu）。
其中有一株同时也出现了第87位点（GAC→AAC）的改变，氨基酸也由Asp→Asn。
除第二步突变体parC第80位点突变（AGC→ATC），引起氨基酸由Ser→Ile的改变外，其余几株均没有发生parC的突变。
MIC测定结果显示，单用两种FQNs及合用CCCP的结果一样。
结论加替沙星限制KP耐药突变株选择的能力强于环丙沙星，KP的耐药突变株对FQNs耐药的主要原因是gyrA和parC基因突变。
【关键词】氟喹诺酮；肺炎克雷伯菌；耐药；防耐药突变浓度ABSTRACTObjectiveTodeterminemutantpreventionconcentration（MPC）oftwofluoroquinolonesforKlebsiellapneumoniae（KP）andcomparethecapacityoffluoroquinolonestopreventtheresistantmutantstrains.MethodsTheKPstrainATCC700603wasenrichedinbroth,andthebacterialconcentrationswereadjustedto1010colonyformingunitspermilliliter.Theminimalinhibitoryconcentration（MIC）andMPCofgatifloxacinandciprofloxacinforKPweredeterminedbyagarplatesdilutionmethod.Quinoloneresistancedeterniningregion（QRDR）ofparCandgyrAgeneswereidentifiedbyPCRamplificationandgenesequencing.TheeffectofeffluxpumpinhibitorCCCPonMICsofgatifloxacinandciprofloxacinforresistantmutantswasdetermidedbyagardilutionmethod.ResultsTheMPCofgatifloxacinandciprofloxacinforKPstrainATCC700603were1.6and4mg/L,andtheMPC/MICwere4and16respectively.TheallstrainshadanTCC→ATCorTCC→TTGmutationincodon83,leadingtoaminoacidchange:
Ser→LeuorSer→Ile.Atthesametime,aGAC→AACmutationwasfoundincodon87whichresultedinaminoacidchange:
Asp→Asn.Exceptforthesecondstepmutant,DNAsequencinganalysisofparCdidnotrevealpointmutation（AGC→ATC）leadingthesubstitutionofaIleforSerin4strains.AsfortheMICs,ofwhichthetwofluoroquinoloneswithCCCPweresameastheMICswithoutCCCP.ConclusionsThecapacityofgatifloxacinforrestrictingtheselectionofKPresistantmutantsisstrongerthanthatofciprofloxacin.ThemutationofgyrAandparCgenesaretheprimarymechanismsresponsingforresistanceofKlebsielapneumoniaetoFQNs.KEYWORDSFluoroquinolones;Klebsiellapneunoniae;Drugresistance;Mutantpreventionconcentration肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneunoniae，KP）是兼性厌氧的革兰阴性菌，通常存在于人类肠道及呼吸道，是目前重要的条件致病菌，其发病率［1］仅次于大肠埃希菌和铜绿假单胞菌。
氟喹诺酮类药物（FQNs）是治疗KP感染的常用药，由于其广泛应用，KP对其耐药性逐年递增。
目前，就新一代FQNs的耐药性及延长其临床使用寿命，国外学者Drlica提出了防耐药突变浓度（mutantpreventionconcentration，MPC）这一概念［2］，该理论在关注抗菌药物预防细菌耐药变异的同时，对临床医师的用药也起到了重要的作用。
关于MPC的研究国内已经开始，但尚未见对KP的报道。
本实验测定了环丙沙星（CPLX）和加替沙星（GTLX）对KP的防耐药突变浓度及耐药突变株对二者的敏感性，以期为临床合理应用FQNs药物提供参考。
1材料1.1菌株受试菌15株，肺炎克雷伯菌ATCC700603（本实验室保存），14株临床分离菌分别来自华西一附院、四川省二院、宜宾市第一人民医院2006年6月～8月临床分离的对环丙沙星敏感菌。
1.2抗菌药物环丙沙星（CPLX广州南新制药有限公司，批号CFI02706）、加替沙星（GTLX浙江亚太药业股份有限公司，批号060206）和羟基氰氯苯腙（CarbonylCyanidemchlorophenylhydrazone，CCCP，美国Sigma公司）。
1.3试剂及仪器MullerHinton（MH）肉汤、MH琼脂、LB肉汤（杭州天和微生物试剂有限公司）。
Taq酶和dNTP（大连宝生物工程有限公司）；DNA纯化试剂盒（北京天为时代）；SDS、EDTA、饱和酚、氯仿、Tris、EB、琼脂糖（博瑞克生物科技有限公司）、高速台式离心机（美国Sigma公司）、DYY6B型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）、PCR扩增议（eppendorf）、凝胶成像议（冷泉港生物科技有限公司）。
2方法2.1MIC测定及两种FQNs药物联合CCCP对耐药突变株的MIC测定参照文献［3］推荐的琼脂二倍稀释法测定CPLX和GTLX对临床分离KP、ATCC700603及不同耐药突变株的MIC，在测定MIC的同时，制备含有泵抑制剂CCCP的平板（CCCP终浓度为20mg/L），与CCCP联用的FQNs的MIC比单用FQNs的MIC降低4倍说明有主动外排机制存在，用大肠埃希S菌ATCC25922作为质控菌。
判断按照参考文献［3］标准。
2.2防耐药突变浓度（MPC）的测定将CPLX和GTLX倍比稀释成不同的浓度，药液和MH琼脂培养基按1∶9的比例在90mm的平板中混匀，配制成浓度高于MIC的系列浓度二倍稀释的含药平板，每个浓度4个平板，置37℃孵箱过夜。
菌液制备参照文献Zhao［4］的方法，单个菌落过夜培养后集菌，把菌液调至1010CFU/ml，取100μl均匀地涂在制备好的含药平板上，孵育24、48和72h后观察结果，以不出现细菌生长的最低药物浓度为该药对这种细菌的MPC值。
2.3菌落恢复生长比率曲线的绘制按照2.2集菌方法集菌后，将1010CFU/ml的菌液倍比稀释成不同浓度至103CFU/ml，将不同浓度菌液100μl涂在含抗菌药物平板上，计数恢复生长菌落数及恢复生长比率，描绘生长比率曲线。
2.4GTLX和CPLX对ATCC700603耐药突变株的选择及其基因组DNA的提取按照上述2.2方法集菌后，将100μl的菌液接种于含2MIC～MPC不同浓度的抗菌药物平皿上，37℃培养48～72h，挑取不同浓度平板上生长的菌落，将这些菌落培养2代后接种于原药物浓度的平板上如仍然生长即为耐药突变株，1、2步耐药突变株均按照此方法选择。
筛选出的耐药突变株用碱裂解法提取基因组DNA，做为PCR的DNA模板。
2.5耐药突变株gyrA基因和parC基因的扩增及测序使用Primer5.0设计引物，gyrA正向引物为5′TGCGAGAGAAATTACACC3′，反向引物为5′AATATGTTCCATCAGCCC3′扩增片段长度为625bp；parC：
正向引物为5′CCAGCGTCGCATCGTCTA3′，反向引物为5′AAAGTTTGGCACCCAGTCG3′，扩增片段长度为319bp。
扩增条件：
反应体系为50μl，94℃预变性3min，循环参数为变性94℃30s，退火gyrA为50℃30s，parC为54℃30s，延伸gyrA为72℃30s，parC为72℃30s，35个循环，72℃延伸10min。
扩增产物经含EB的1%琼脂糖凝胶电泳后照像（图1）。
PCR产物按照产物纯化试剂盒纯化后委托上海英骏公司测序。
3结果3.1GTLX和CPLX对KP临床分离株、ATCC700603及其耐药突变体的MPC、MIC两种药物对ATCC700603的MIC值：
GTLXN：
空白对照；M：
DNAmarker；1～6：
分别为耐药突变体gyrA、parC基因扩增产物图1gyrA基因扩增产物电泳图（0.4μg/ml）CPLX（0.25μg/ml），MPC值：
CPLX（8μg/ml）GLXT（1.6μg/ml），选择指数（MPC/MIC）：
GTLX（4）3.2GLXT和CPLX对临床分离株的MPC及MIC值90%菌株的MIC显示GTLX的MIC值大于CPLX，MPC值小于CPLX，选择指数为GTLX3.3两种FQNs对KP标准菌的菌落恢复生长比率曲线随着FQNs药物浓度逐渐增加，细菌恢复生长的菌落数出现两次明显下降。
第1次下降发生在MIC99；随着药物浓度增加，恢复生长的菌落数逐渐减少并维表1GTLX和CPLX对临床分离KP及ATCC700603的MIC
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