MLPA多重连接探针扩增试剂盒_精品文档.pdf

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MLPA多重连接探针扩增试剂盒（multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA）厦门火炬高新（翔安）产业区翔星路88号台湾科技企业育成中心E401室电话：

（86）400-661-8810（免费）0592-76150885761720传真：

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361105网址：

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/厦门致善生物科技有限公司神经遗传学和智障mRNAAnalysis遗传性疾病甲基化检测遗传药理学肿瘤表征遗传性肿瘤基础研究产前诊断新生儿诊断目录MLPA简介产前诊断与新生儿诊断神经遗传学与智障遗传性肿瘤与肿瘤表征药物基因组学甲基化检测mRNAAnalysis（RT-MLPA）其它产品附录1样品处理附录2核酸提取系统附录3唾液收集器介绍16152844465355656871R厦门致善生物科技有限公司成立于2010年2月，位于厦门火炬（翔安）产业区内。

公司具有雄厚的技术力量和丰富管理经营经验的专业人员，一流的科研开发团队为公司技术的持续创新提供了源源不断的动力。

目前公司建有1000多平方米的标准洁净厂房，拥有完善的生产技术和仪器设备，并建立了高标准规范化的体外诊断试剂质量管理体系，为产品的质量提供坚实的保证。

公司致力于新型第三代分子诊断试剂的研发生产，主要产品有：

遗传病系列核酸检测试剂盒、传染病系列核酸检测试剂盒、肿瘤系列核酸检测等系列试剂盒，以及可见光电泳透射仪、自动化核酸提取系统等，产品已广泛应用于医院、疾控、科研、商检等多个领域。

公司以“自主创新、服务社会”宗旨，探索高科技产业发展之路，旨在不断超越自我，建立现代企业管理制度，以科技创新创造社会价值，以诚挚服务提高人民健康水平，努力创建世界一流生物高科技企业。

发展战略：

企业宗旨：

自主创新，合作共赢以人为本，服务社会公司作为分子诊断教育部工程研究中心的产业化基地，已获得国家食品药品监督管理局颁发的医疗器械生产企业许可证及医疗器械经营企业许可证，并通过了国家食品药品监督管理局体外诊断试剂生产质量管理体系考核，具备体外诊断试剂产业化能力。

企业简介企业宗旨企业资质2多重连接依赖探针扩增（MultiplexLigation-dependentProbeAmplification,MLPA）能够在一个简单的反应内检测多达50个核酸序列的拷贝数变化，因此能够检测大量基因的缺失和重复，还可用于血液和肿瘤组织样品的DNA和mRNA谱的检测，并可分析甲基化。

迄今，已经公认为一种可靠和有效的方法，自2002年首次报道以来，该技术已在全球的900多家实验室得以应用，使用该技术发表的论文已近千篇。

小范围基因重组的检测：

已检测的基因包括：

BRCA1,BRCA2,MSH2,MLH1,DMD,APC,SMA,NF1,NF2,VHL,TSC1/2,MECP2,NSD1,LDLR,FBN1,CFTR,DPYD,COL5A1,CACNA1A,PKHD1,BRIP1,SLC26A4,LMN1B,PRSS1,FRMD7,TPMT,FLCN,DNAI1,EP300,DNAH5,UBE3A,PCCA,PCDH15等；大范围基因重组的检测：

已检测的疾病类型包括：

Williamssyndrome,Prader-Willi/Angelmansyndrome,DiGeorgesyndrome,CriduChat,Pelizaeus-Merzbacher,CMT1,HNPP等；亚端粒区域的拷贝数变化；染色体非整倍体（包括羊水细胞样品）；肿瘤诊断：

如ALL,CLL,oligodendrogliomas,melanomas,neuroblastomas的DNA拷贝数变化；甲基化定量检测：

涉及的疾病包括Prader-Willi/Angelman,BeckwithWiedemann,MGMT,MLH1,FragileX以及抑癌基因的失活。

mRNA分析：

涉及细胞凋亡和炎症反应。

目前MRC-Holland供应的SALSAMLPA试剂盒已多达300多个品种，而且通过与全球科学家的合作，新品种正在源源不断地开发出来。

遗传性疾病：

PKHD1,EHMT1,COL11A1,DPP6-CRKL,CYP4V2,SOX10-GFRA-EDNRB,VWF,LRP5,SPRED1,POR,PKD1/PKD2,TCOF1,ACADVL,VPS13B,TCF4-FOXG1,NPC1,NPC2,SPRED1,AGXT-GRHPR,LARGE,UBE3A,TPO-PAX8-FOXE1-TSHR,FCGR基因簇分析,BRCA2确认试剂。

肿瘤：

P335IKZF1-ALL,P202IKZF1,P370BRAF失活-IDH突变。

检测一个样品中50个基因序列的拷贝数变化，基于PCR反应。

仅需20ng人类基因组DNA（3000细胞或者约0.5mL羊水）。

可以使用细胞裂解物代替纯化的核酸。

能够区分只有一个检测差异的核酸序列。

不同的应用，同一个程序。

高通量：

24小时内获得结果。

仅需一个普通PCR仪和一个测序仪。

试剂盒包含了所有必须试剂。

MLPAMLPAMLPA高效灵敏的基因组和甲基化分析方法MLPA的应用领域新近上市的SALSAMLPA试剂盒MLPA的特点MLPA的工作原理MLPA采用多重PCR的方式进行检测核酸样品，可用一对引物同时扩增多达45个特异的核酸列。

扩增产物可用测序仪检测。

按照MLPA的设计，每个扩增产物都有独一无二的长度，并按照6到9个核苷的梯度逐步增加，总长度在120500碱基之间。

这一范围特别适合测序仪的有效分离和低背景检测。

对于普通的多重PCR而言，每一个片段都需要一对引物。

大量引物的共存产生一系列的问题。

首先，由于不同引物之间的效率存在差异，难以对各个靶序列进行准确定量。

其次，实验条件的微小差异常常就会导致结果的巨大差别。

MLPA的最大好处就在于所有的片段都由一对引物扩增。

如何实现用一对引物扩增50个不同的靶序列呢？

对常规的多重PCR而言，这几乎是不可能的任务。

MLPA的窍门在于扩增的对象并非样DNA而是加入样品中的MLPA探针。

MLPA探针包括一对寡核苷酸，后者含有引物的结合序列。

只有当这两个探针与靶序列杂交并连接，才能被PCR指数扩增。

因此，探针连接产物的数目就取决于样品中靶序列的数目。

例如，如果定量检测50个序列，我们就向样品中加入50对不同的MLPA探针。

每一对都与待测的靶序列互补。

如前所述，每对MLPA探针是紧挨着杂交的，并且每个探针都含有引物识别序列。

杂交后，两个探针被一个特异的连接酶催化连接成一条长的探针序列。

需要指出的，此处的连接反应十分特异，即使存在单个碱基的差异也能区别出来。

由于连接后的长片段里包含引物识别序列，就可以在PCR反应中被指数扩增。

那些没有连接的探针，只含有单个引物识别的序列，无法被扩增。

因此，在MLPA中并不需要除去未结合的探针。

尽管使用同一对引物，总有某些序列的扩增效率可能低1-2%，最终产生较低的峰面积。

因此，一次MLPA扩增谱并不足以确定拷贝数变化，必须与参考样品对照后才能确定。

通过与参考样品对照，扩增产物的相对峰面积就能反映出探针靶序列的相对拷贝数。

因此，病人样品中发生外显子的缺失，就很容易地从扩增产物的相对峰面积的降低看出来（图2）。

MLPA反应的探针浓度和杂交时间确保了与靶序列的完全杂交。

在一个典型的MLPA反应中，探针的拷贝数为500,000,000个，而一个含有60ng人类基因组的样品中仅有20,000拷贝的靶序列。

延长杂交时间或者增加更多的探针并不影响检测的结果，因此反应十分稳定。

如前所述，未连接的探针无法被扩增，也不会产生荧光信号。

因此，扩增产物的相对信号强度就取决于样品中待测序列的拷贝数。

因为过量的MLPA探针无需出去，MLPA的操作流程极为简单。

MLPA简介MLPA简介MLPA简介RMLPA的操作流程1.DNA变性：

于98C加热5分钟；2.杂交：

加入SALSA探针混合物和MLPA缓冲液，于95C温浴1分钟，然后于60C杂交16小时；3.连接：

加入连接酶混合液，于54C温浴15分钟。

再于98C加热5分钟使连接酶失活；4.加入引物，dNTPs和聚合酶，开始PCR扩增；5.毛细管电泳：

将片段长度和峰面积输出到软件或者表单上，分析结果。

MLPA的优点1.MLPA技术可用于多种检测体系中，不同体系之间唯一的差异就是探针；2.MLPA属于多重检测：

一个反应可以提供多达50个靶序列的信息。

对于绝大多数应用而言，已经可以满足医生的需求；3.MLPA相对经济：

每一个MLPA试剂盒可以进行100次检测，试剂盒提供了所有试剂（探针混合液、缓冲溶液、连接酶、聚合酶、dNTPs和标记的PCR引物）；4.MLPA重现性好，易操作，多个样本可同时检测；5.MLPA灵敏度高：

只需20ng人类基因组DNA，结果不受样品DNA量的影响；6.MLPA可以区分靶序列中单个碱基的差异，在复杂的人类基因组混合样品中，能够检测微小的拷贝数变化，比如3拷贝与2拷贝的差异；7.MLPA检测的靶序列长度只有约60个碱基，因此可用于检测单个外显子的缺失或重复；8.投资少：

所需的仪器包括一个普通的热循环仪和测序仪，两者都是多数分子生物的常规仪器。

而且价格相对的测序仪也不是必须的，可以用LICOR和ABI373和377代替。

1.MLPA只能检测探针覆盖序列的拷贝数变化。

2.如果靶序列中发生突变或者多态性，会导致相对峰面积下降。

3.MLPA主要用于识别基因组的缺失或者插入，不大适合检测未知突变。

尽管如此，MLPA还是能够检测已知（点）突变，如可以把突变位点设计在探针的连接位点，一旦发生突变，就是导致峰面积的下降。

4.MLPA对于样品中的污染物（如少量残留的苯酚等PCR抑制剂）较普通PCR敏感。

但是，此类污染很容易识别，因为此时那些峰面积较小的扩增产物（如长探针）会出现峰高降低，从福尔马林固定石蜡包买的组织样品提取的DNA都能得到很好的检测。

5.开发SALSAMLPA试剂盒过程复杂，昂贵而且耗时：

因为每一条探针都需要从M13噬菌体克隆出发进行设计和制备，而且需要纯化和酶切，后者需要使用昂贵的限制性内切酶。

然而，目前MRC-Holland公司已经能够提供250多个MLPA试剂盒，而且可以应客户要求设计新的探针组合。

出于研究目的，用户可以自行设计合成探针。

有关指南和PCR引物信息见。

6.与FISH相比，MLPA不能对单个细胞进行分析。

MLPA的分析结果来自混合细胞中的基因组DNA，因此反映的是每个细胞的平均拷贝数。

对于肿瘤分析而言，当肿瘤细胞的含量低于50%时，某些基因变异可能难以检出。

甲基化特异的MLPA（MS-MLPA）逆转录MLPA（RT-MLPA）是将MLPA用于mRNA谱检测的一种形式，用于替代实时PCR和微阵列。

应用包括细胞凋亡和炎症反应相关基因分析。

RT-MLPA并不直接检测mRNA，因为Ligase-65并不能连接结合于RNA靶序列上的DNA探针。

为了解决这一问题，RT-MLPA的探针就设计成与cDNA结合，RT-MLPA试剂盒包含逆转录酶引物混合物，用于生成cDNA。

每一组MLPA探针，都有一条逆转录引物，该引物紧挨着探针识别位点。

由于两个MLPA探针的杂交序列只有5273个碱基，RT引物也需要延伸仅仅50到70个碱基，就足以提供所需要的cDNA了。

因为如此短的cDNA片段就可供检测，RNA降解对于检测结果的影响就应该很小。

可以将RT-MLPA直接用于福尔马林固定的石蜡包埋组织，当然成功率受组织储存条件（如pH水平，组织块的年限等）的影响很大。

更多关于RT-MLPA的信息参见RT-MLPA操作流程。

MS-MLPA是一种半定量的甲基化检测方法，该技术从标准的MLPA方法衍生而来。

其主要用途是检测印迹区域的异常甲基化，比如检测Prader-Willi综合征/Angelm