腺病毒提取与纯化_精品文档.pdf
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腺病毒提取与纯化腺病毒提取与纯化一、物品准备：
一、物品准备：
1、离心管：
BackmanCat：
#331372（36000rpm离心用13.2ml）；BackmanCat：
#342412（65000rpm离心用5.1ml）；消毒，多备用一套；2、离心管帽：
离心管BackmanCat：
#331372盖，消毒；离心管BackmanCat：
#342412外盖；离心管BackmanCat：
#342412中盖，BackmanCat：
#342883；3、热封盖：
离心管BackmanCat：
#342412热封盖，消毒；4、其他物品：
MiniQ：
2L，消毒；大烧杯（1L）：
2个，消毒；中号镊子，小号镊子：
1把中号和3把小号，消毒；无菌注射器：
1ml、5ml、10ml，若干；移液枪：
1把；移液管：
2ml、10ml，若干；废液缸：
1个；无菌手套：
若干；酒精、棉球；Marker笔；二、配液：
1、CsCl：
1.25g/ml：
9.04gCsCl+25mlPBS；1.35g/ml：
12.8gCsCl+25mlPBS；1.40g/ml：
15.5gCsCl+25mlPBS；配好后过滤。
2、Viruslysisbuffer（pH7.4，50ml）：
0.1%SDS0.05g10mMTrisbase0.0606g1mMEDTA0.0186g3、Dialysisbuffer（pH7.6，1.5L）：
10mMTrisbase1.82g135mMNaCl11.83g1mMMgCl20.143g50%Glycerol750ml三、裂解扩增了腺病毒的293细胞：
1、从-80冰箱中取出以前扩增好的感染病毒的293细胞沉淀，解冻后用4mlPBS重悬，并转移到置于冰上的50ml离心管中；2、用绳子拴好50ml离心管，置于液氮中30分钟；3、取出后置于37水浴，摇至溶解，最大速度vortex一分钟，离心，5000rpm，10分钟；4、转移上清到一个15ml的离心管中；5、向下层沉淀中加入3ml的PBS，vortex混匀，再放于液氮中，再反复冻融两次，收集到的裂解液不超过9ml为宜；6、把收集到的上清再离心5000rpm，10分钟（上清可暂时不取出，节省步骤），放于冰上。
四、正式实验：
预冷转头至4（BackmanSW41Ti及其离心管套，BackmanVTi90），热封仪充电。
1、UV消毒超净台，检查离心机配件：
转头SW41Ti及离心管套、离心管（Cat：
#331372）、离心管盖、离心管盖固定器、离心管架；2、取出消毒好的离心管放在专用的离心管架上，用移液枪分别加2ml1.25g/mlCsCl，再在液体的底部缓慢加入1ml1.40g/mlCsCl；注：
加入时将移液管伸入到离心管底部，将移液枪调到最低档缓慢加入，拔出移液枪时也要慢，加好后可以看到不同浓度的CsCl之间有明显的分层。
4、用移液枪将293裂解液缓慢加满，配平，按1-4，2-5，3-6的顺序；注：
管子要注意做好标记。
5、用酒精擦离心管套，把装好样本的离心管轻轻放入，放上消毒好的盖子，用离心管盖固定器拧紧；注：
离心时6个离心管套都要挂上，空的离心管套也需盖上盖子并拧紧，并挂在相应的挂钩上，注意平衡。
6、离心36000rpm，65min，4；设置参数：
36000rpmenter65minenter4enterenter+star；当真空750时，开始加速，约3min可达36000rpm。
7、离心时，检查下一步离心所需配件：
转头BackmanVTi90、离心管（Cat：
#342412）、离心管架、离心管外盖、离心管中盖（Cat：
#342883）、专用螺丝、专用扳手、专用离心管加夹；8、离心完成后，小心取下离心管套，拧开盖子，用镊子取出离心管，找到要抽取的完整病毒带；9、穿刺病毒带：
用5ml注射器从病毒带下方约1ml处缓慢向斜上放刺入，抽取病毒带，抽完后用手堵住离心管上口，再将枕头抽出；注：
穿刺处先用酒精消毒，刺入时旋转，不要太用力，针头平面向上，注意不要回打，抽到病毒约1ml。
FromAdEasyVectorSystem，Qbiogene,Inc.10、将抽出来的病毒转移到5.1ml离心管（Cat：
#342412）中，用1.35g/mlCsCl填满；注：
加CsCl时要轻轻弹一弹管壁以清除气泡，加CsCl时针头应在液面以下，以减少气泡的产生，若残留气泡容易导致离心时不平衡，离心管变形。
11、热封：
用消毒好的热封盖盖好离心管口，用热封仪（cat358314）加热，垂直轻轻下压到离心管颈部与管身交界处（约30sec），用冷却管套住热封管盖冷却；12、将热封好的离心管放入到转头BackmanVTi90的对称位置，依次加入内盖、外盖，先用专用螺丝拧，再用专用扳手拧紧（用力到扳手指针达120即可）；13、离心：
转头BackmanVTi90，72300rpm，3h，4；14、离心时，用75酒精消毒透析袋（剪成约5cm一个，不要太短）、夹子（要配套，一个带磁铁和一个不带磁铁），30min以上；15、离心完后，用专用的离心管夹取出离心管后置于架子上；16、第二次穿刺：
用10ml注射器针头导气，用1ml针管配5ml的针头穿刺病毒带（从病毒带下方约0.5cm处斜向上刺入），方法同前；17、病毒带抽完后，抽出注射器，用针头套套住针头，标记好至于冰上；18、透析：
取出浸泡于酒精中的透析袋，用牙签撑开透析袋，用消毒的milli-Q水冲净其上的酒精，再末端折叠一下，用夹子夹好。
将注射器中的液体注射入袋中，折叠上端，用夹子夹住，放于透析液中，隔1小时换液一次，反复3次。
最后一次的透析缓冲液保存至下次使用；注：
小心针头不要刺穿透析袋，夹子要做好标记。
19、收集病毒：
取出透析袋，用消毒milli-Q冲洗透析袋，用酒精棉球擦夹子内缘，在夹子内缘剪开透析袋，用200ul枪吸出液体转移到标记好的1.5mlEP管中-20保存；20、测浓度：
1）、要用复温好的Viruslysisbuffe裂解腺病毒：
取6ul病毒加入54ulViruslysisbuffe，第三次透析液为空白对照，做好标记；2）、水浴裂解：
56，10min；3）、测dsDNA，OD260：
首先用空白对照调零，然后放入样本读数，若在0.1-1.0之间，则可以准确反映病毒浓度，否则需要稀释或加浓。
21、计算腺病毒浓度：
公式：
VP/ml=（OD260）稀释倍数1.11012
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