磁性纳米颗粒Fe3O4@SiO2的制备及在全血DNA提取中的应用_精品文档.pdf
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I临床检验杂志2016年3月第34卷第3期ChinJClinLabSci，Mar2016，V0134，No3169DOI：
1013602jcnki恤120160303临床检验技术研究磁性纳米颗粒Fe。
04Si02的制备及在全血DNA提取中的应用水王念跃1，马超23，李传燕2，王芳2（1东南大学附属第二医院检验科，南京210003；2东南大学生物电子学国家重点实验室，南京210096；3徐州医科大学医学信息学院，江苏徐州221004）摘要：
目的自制Fe30。
Si02磁性纳米颗粒并评价在全血样本中DNA提取效果，进一步研究开发磁珠法检测HBVDNA的技术。
方法采用溶剂热法自制Fe30。
磁性纳米颗粒，并用表面化学修饰法制备Fe30。
SiO：
磁性复合颗粒；利用该颗粒经吸附、洗涤、洗脱等步骤提取全血样本中DNA，并通过电泳、PCR扩增等传统技术检测DNA提取效果，与煮沸法提取血清DNA样本的效果进行对比。
结果成功制备出直径约550nm的Fe30。
Si02磁性纳米颗粒，该颗粒分散均匀；自制的磁性纳米颗粒可用于全血DNA提取与纯化，实验操作简便。
自制磁性纳米颗粒提取全血DNA浓度为15056nspL，纯度为153；该提取方法与传统煮沸裂解法对96份样本进行对照研究，证实其灵敏度有较大提高。
结论利用自制的Fe，O。
SiO，磁性纳米颗粒和合适的缓冲液体系，可成功地提取纯度较高的DNA，通过PCR扩增及对比实验表明，该磁性纳米颗粒及其提取工艺经优化后，可用于传染病的体外分子诊断研究。
关键词：
磁性纳米颗粒；制备；乙肝病毒；核酸提取；PCR扩增中图分类号：
R4465文献标志码：
A磁性纳米粒子（magneticnanoparticles，MNPs）是一种新型功能材料，具有尺寸较小、比表面积大、表面活性高、生物相容性和流体稳定性好、比饱和磁化强度高及在外磁场作用下快速响应等优良特性，已在生物医学领域中应用广泛j。
本研究应用本实验室制备的Fe，O。
SiO：
磁性纳米颗粒对全血样本的核酸进行提取，并将该方法与传统的煮沸裂解法的提取效果进行比较，以期为下一步的自动化乙型肝炎病毒分子实验诊断提供实验依据。
1材料与方法11样本来源收集2015年9月2_4日南京市第二医院96例乙型肝炎（简称乙肝）住院患者EDTAK，抗凝全血及血清各l份（无溶血、脂血），男64例，女32例，平均年龄435岁（年龄范围2176岁），诊断符合2000年中华医学会传染病与寄生虫学分会、肝病学分会修订的病毒性肝炎防治方案标准心。
所有标本均清晨抽取静脉血，4保存，收集完毕后集中检测。
12主要试剂与仪器六水合三氯化铁（FeCl，6H：
0）、无水醋酸铵（NH。
Ac）购自国药集团化学试剂公司；乙二醇、正硅酸乙酯（tetraethylorthosilicate，TEOS）、氨水和无水乙醇等常用化学试剂购于南京化学试剂公司，均为分析纯；蛋白酶K、DNAmarker、PCR及其他未提及的各种试剂均购自上海生工公司；GelRedlM核酸荧光染料（美国Biotium公司）；JEM-2100型透射电子显微镜（日本电子公司）；NanoDrop2000超微量紫外可见分光光度计（美国ThermoScientific公司）。
13实验所用溶液的配制131裂解液配制称取1915g盐酸胍（GuHCl）pJ、0185gEDTA、003gNaCl、2mLTritonX一100，ddH20定容至100mL，混匀1。
132结合液称取20gPEG-6000，175gNaCl，ddH：
O定容至100mL。
133清洗液添加70mL无水乙醇，ddH：
O定容至100mL。
134洗脱液称取0121gTris-HCl、004gEDTA，调pH至80，ddH20定容至100mL。
14方法141溶剂热法制备Fe，O。
磁性纳米颗粒及表征称取135gFeCl36H20，向其中加入50mL乙二醇，磁力搅拌使其充分溶解，向混合物中继续加入321g无水乙酸铵，磁力搅拌使其充分溶解H1。
将上述混合物缓慢转移到50mL聚四氟乙烯内衬反应釜中，将反应釜不锈钢外套拧紧后，置于鼓风干燥箱中200反应12h。
待反应结束后，自然冷却至室温后，打开反应釜，将内部所得黑色产物转移至一个洁净烧杯中，借助外加磁场分别用去离子水和无水乙醇清洗产物多次至上清液pH为中性，并最终将产物分散在无水乙醇中，4保存。
取适量充分稀释后的样品利用超声波充分混匀分散后，取一滴样：
f=基金项目：
南京市科技发展计戈tJ（201208038）；南京市医学重点科技发展项目（2KXl2038）。
作者简介：
王念跃，1958年生，男，主任技师，主要从事感染性疾病实验室诊断技术研究工作。
万方数据170临床检验杂志2016年3月第34卷第3期ChinJClinLabSci，Mar2016，V0134，No3品滴在喷有碳膜的铜网上，室温干燥后在透射电子显微镜下（加速电压为200kV）观察Fe，O。
磁性纳米颗粒的大小、形貌。
142Fe，O。
SiO：
磁性复合颗粒的制备与表征首先将合成的Fe，O。
磁性颗粒（含无水乙醇）加入到三口烧瓶中，磁分离后去上清，然后分别向三口烧瓶中加人120mLH，0和30mL无水乙醇。
将三口烧瓶置于超声波清洗机中超声分散3min，将三口烧瓶固定于恒速搅拌器上，在N：
的保护下，向烧瓶内均匀加入3mL浓氨水和15mLTEOS，机械搅拌反应3h，反应完毕后在外加磁场的作用下，将反应物用ddH：
O清洗至pH为中性，定容至10mgmL，4保存备用。
利用TEM对Fe，O。
SiO：
进行表征，方法与Fe，O。
磁性颗粒的透射电子显微镜表征方法相同。
143磁珠法全血DNA提取步骤：
（1）细胞裂解。
在15mLEP管中，依次加入100xL全血样本、100止裂解液和20斗L蛋白酶K（10mgmL），涡旋振荡摇匀后，56水浴20min。
（2）磁性颗粒与结合液混合。
取100IxL（10m#mL）Fe，04SiO：
磁性颗粒于新的15mLEP管中，磁力架磁分离1min，弃上清。
向EP管中加人300IxL结合液，涡旋混匀，备用。
（3）吸附DNA。
将步骤
（1）裂解处理的样品加入步骤
（2）的EP管中，涡旋混匀，室温静置5min，磁分离2min后弃上清。
（4）洗涤。
用400txL清洗液清洗（3）中的磁性复合颗粒3次，磁分离弃上清，真空离心浓缩干燥或自然晾干。
（5）洗脱。
向晾干的离心管中加入100IxL的洗脱液，涡旋混匀使颗粒悬浮，置水浴锅中65温育10min，期间摇匀23次，磁分离吸取的上清液即为提取的DNA样本。
实验重复2次。
将提取的核酸样本进行琼脂糖凝胶（10L）电泳，用NanoDrop2000超微量紫外可见分光光度计进行产量和浓度检测。
144煮沸法血清DNA提取在15mLEP管中加100IxL血清和20斗L裂解液（同磁珠法），涡旋混匀，煮沸10min；5000rmin离心5min，轻轻吸取上清液于另一清洁的离心管中，加入20斗L04mmolLTris-HCl（pH75），4保存备用。
145DNA提取产物的PCR验证分别对磁性颗粒提取法和煮沸裂解法提取的DNA样本进行PCR扩增。
采用Blast和ClustaW软件比对分析，参照HBV的x蛋白编码基因的部分区段并稍作修改，设计一对HBVDNA特异性引物，扩增片段大小约为120bp，正向弓I物序列：
5一ccGTCTGTGcCTTcTCATCTG37，反向弓I物序列：
57一AGTCCAAGAGTTCTCTTATGCAAGACCTY37，由上海生工公司合成。
PCR扩增体系为20止，成分主要包括10Taq酶缓冲液（不含M92+）2IxL，15mmolLMgCl208弘L，250molLdNTPs05灿L，05斗molL上、下游引物各1IxL，模板2斗L和5U<aqDNA聚合酶03止，ddH：
O补足体积。
扩增条件：
95预变性3min；95变性15s，60退火60S，72oC延伸60S，循环45次；72延伸7rain；4oC保存。
扩增产物用16gL琼脂糖凝胶电泳检测。
15实时荧光定量PCR检测HBVDNA磁珠法与煮沸法分别提取的DNA均用同一PCR仪（ABI7500型）平行定量检测HBV载量，扩增条件如145，采用SYBGreen荧光染料进行检测引。
16统计学分析采用SPSS190软件进行。
计数资料的比较采用，检验，一致性验采用Kappa检验进行分析，回归方程采用双变量的线性回归，以P005为差异有统计学意义。
2结果21Fe，O。
磁性颗粒与Fe30。
SiO：
磁性复合颗粒的表征Fe，O。
磁性颗粒和Fe，O。
SiO：
磁性复合颗粒的形状均为球形，粒径比较均匀，且分散性比较好。
Fe，O。
磁性颗粒的粒径约为500liB，颗粒中心与外周颜色相同，可判断该颗粒为实心状；同时发现，颗粒表面呈现有更为精细的结构，该结构是由粒径极小的Fe，O。
磁性纳米颗粒组成。
Fe，O。
SiO：
磁性复合颗粒具有明显的核壳结构，中间黑色区域为实心Fe，O。
磁性颗粒，周围灰色区域为SiO：
壳，厚度为5080am。
整个磁性复合颗粒粒径主要集中在550nm左右。
见图1。
22磁珠法提取DNA结果221磁珠法提取全血DNA经磁珠法提取全血DNA电泳见图2。
由图可知，磁性颗粒提取法所得DNA电泳条带单一，分子量约23000bp，无拖尾现象。
说明提取的样本DNA纯度较高。
222磁珠法提取全血DNA纯度与浓度A260。
们。
值为153，略低于170，说明存在少量蛋白质污染。
本研究磁性颗粒提取的全血DNA样品浓度为15056ng斗L。
万方数据临床检验杂志2016年3Jj第34卷第3期ChillJClinLabSci，Mar2016，V0134，No3AB口图1F
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