磁性纳米颗粒Fe3O4@SiO2的制备及在全血DNA提取中的应用_精品文档.pdf

1、I 临床检验杂志2 0 1 6 年3 月第3 4 卷第3 期C h i nJC l i nL a bS c i，M a r 2 0 1 6，V 0 1 3 4，N o 31 6 9 D O I：1 0 1 3 6 0 2 j c n k i 恤12 0 1 6 0 3 0 3临床检验技术研究磁性纳米颗粒F e。0 4 S i 0 2 的制备及在全血D N A 提取中的应用水王念跃1，马超2 3，李传燕2，王芳2(1 东南大学附属第二医院检验科，南京2 1 0 0 0 3；2 东南大学生物电子学国家重点实验室，南京2 1 0 0 9 6；3 徐州医科大学医学信息学院，江苏徐州2 2 1 0 0

2、4)摘要：目的自制F e 3 0。S i 0 2 磁性纳米颗粒并评价在全血样本中D N A 提取效果，进一步研究开发磁珠法检测H B VD N A 的技术。方法采用溶剂热法自制F e 3 0。磁性纳米颗粒，并用表面化学修饰法制备F e 3 0。S i O：磁性复合颗粒；利用该颗粒经吸附、洗涤、洗脱等步骤提取全血样本中D N A，并通过电泳、P C R 扩增等传统技术检测D N A 提取效果，与煮沸法提取血清D N A样本的效果进行对比。结果成功制备出直径约5 5 0n m 的F e 3 0。S i 0 2 磁性纳米颗粒，该颗粒分散均匀；自制的磁性纳米颗粒可用于全血D N A 提取与纯化，实验操

3、作简便。自制磁性纳米颗粒提取全血D N A 浓度为1 5 0 5 6n s p L，纯度为1 5 3；该提取方法与传统煮沸裂解法对9 6 份样本进行对照研究，证实其灵敏度有较大提高。结论利用自制的F e，O。S i O，磁性纳米颗粒和合适的缓冲液体系，可成功地提取纯度较高的D N A，通过P C R 扩增及对比实验表明，该磁性纳米颗粒及其提取工艺经优化后，可用于传染病的体外分子诊断研究。关键词：磁性纳米颗粒；制备；乙肝病毒；核酸提取；P C R 扩增中图分类号：R 4 4 6 5文献标志码：A磁性纳米粒子(m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s，M N

4、 P s)是一种新型功能材料，具有尺寸较小、比表面积大、表面活性高、生物相容性和流体稳定性好、比饱和磁化强度高及在外磁场作用下快速响应等优良特性，已在生物医学领域中应用广泛j。本研究应用本实验室制备的F e，O。S i O：磁性纳米颗粒对全血样本的核酸进行提取，并将该方法与传统的煮沸裂解法的提取效果进行比较，以期为下一步的自动化乙型肝炎病毒分子实验诊断提供实验依据。1 材料与方法1 1 样本来源收集2 0 1 5 年9 月2 _ 4 日南京市第二医院9 6 例乙型肝炎(简称乙肝)住院患者E D T A K，抗凝全血及血清各l 份(无溶血、脂血)，男6 4 例，女3 2 例，平均年龄4 3 5

5、岁(年龄范围2 1 7 6岁)，诊断符合2 0 0 0 年中华医学会传染病与寄生虫学分会、肝病学分会修订的病毒性肝炎防治方案标准心。所有标本均清晨抽取静脉血，4 保存，收集完毕后集中检测。1 2 主要试剂与仪器六水合三氯化铁(F e C l，6 H：0)、无水醋酸铵(N H。A c)购自国药集团化学试剂公司；乙二醇、正硅酸乙酯(t e t r a e t h y lo r t h o s i l i c a t e，T E O S)、氨水和无水乙醇等常用化学试剂购于南京化学试剂公司，均为分析纯；蛋白酶K、D N Am a r k e r、P C R 及其他未提及的各种试剂均购自上海生工公司；G

6、 e l R e d l M 核酸荧光染料(美国B i o t i u m 公司)；J E M-2 1 0 0 型透射电子显微镜(日本电子公司)；N a n o D r o p2 0 0 0 超微量紫外可见分光光度计(美国T h e r m oS c i e n t i f i c 公司)。1 3 实验所用溶液的配制1 3 1裂解液配制称取1 9 1 5g 盐酸胍(G u H C l)pJ、0 1 8 5gE D T A、0 0 3gN a C l、2m LT r i t o nX 一1 0 0，d d H 2 0 定容至1 0 0m L，混匀1。1 3 2 结合液称取2 0gP E G-6

7、0 0 0，1 7 5gN a C l，d d H：O 定容至1 0 0m L。1 3 3 清洗液添加7 0m L 无水乙醇，d d H：O 定容至1 0 0m L。1 3 4 洗脱液称取0 1 2 1gT r i s-H C l、0 0 4gE D T A，调p H 至8 0，d d H 2 0 定容至1 0 0m L。1 4 方法1 4 1 溶剂热法制备F e，O。磁性纳米颗粒及表征称取1 3 5gF e C l 3 6 H 2 0，向其中加入5 0m L 乙二醇，磁力搅拌使其充分溶解，向混合物中继续加入3 2 1g 无水乙酸铵，磁力搅拌使其充分溶解H 1。将上述混合物缓慢转移到5 0m

8、L 聚四氟乙烯内衬反应釜中，将反应釜不锈钢外套拧紧后，置于鼓风干燥箱中2 0 0 反应1 2h。待反应结束后，自然冷却至室温后，打开反应釜，将内部所得黑色产物转移至一个洁净烧杯中，借助外加磁场分别用去离子水和无水乙醇清洗产物多次至上清液p H 为中性，并最终将产物分散在无水乙醇中，4 保存。取适量充分稀释后的样品利用超声波充分混匀分散后，取一滴样：f=基金项目：南京市科技发展计戈t J(2 0 1 2 0 8 0 3 8)；南京市医学重点科技发展项目(2 K X l 2 0 3 8)。作者简介：王念跃，1 9 5 8 年生，男，主任技师，主要从事感染性疾病实验室诊断技术研究工作。万方数据1 7

9、 0 临床检验杂志2 0 1 6 年3 月第3 4 卷第3 期C h i nJC l i nL a bS c i，M a r 2 0 1 6，V 0 1 3 4，N o 3品滴在喷有碳膜的铜网上，室温干燥后在透射电子显微镜下(加速电压为2 0 0k V)观察F e，O。磁性纳米颗粒的大小、形貌。1 4 2F e，O。S i O：磁性复合颗粒的制备与表征首先将合成的F e，O。磁性颗粒(含无水乙醇)加入到三口烧瓶中，磁分离后去上清，然后分别向三口烧瓶中加人1 2 0m LH，0 和3 0m L 无水乙醇。将三口烧瓶置于超声波清洗机中超声分散3m i n，将三口烧瓶固定于恒速搅拌器上，在N：的保护

10、下，向烧瓶内均匀加入3m L 浓氨水和1 5m LT E O S，机械搅拌反应3h，反应完毕后在外加磁场的作用下，将反应物用d d H：O 清洗至p H 为中性，定容至1 0m g m L，4 保存备用。利用T E M 对F e，O。S i O：进行表征，方法与F e，O。磁性颗粒的透射电子显微镜表征方法相同。1 4 3 磁珠法全血D N A 提取步骤：(1)细胞裂解。在1 5m LE P 管中，依次加入1 0 0 x L 全血样本、1 0 0 止裂解液和2 0 斗L 蛋白酶K(1 0m g m L)，涡旋振荡摇匀后，5 6 水浴2 0m i n。(2)磁性颗粒与结合液混合。取1 0 0I x

11、 L(1 0m#m L)F e，0 4 S i O：磁性颗粒于新的1 5m LE P 管中，磁力架磁分离1m i n，弃上清。向E P 管中加人3 0 0I x L 结合液，涡旋混匀，备用。(3)吸附D N A。将步骤(1)裂解处理的样品加入步骤(2)的E P 管中，涡旋混匀，室温静置5m i n，磁分离2m i n 后弃上清。(4)洗涤。用4 0 0t x L 清洗液清洗(3)中的磁性复合颗粒3 次，磁分离弃上清，真空离心浓缩干燥或自然晾干。(5)洗脱。向晾干的离心管中加入1 0 0I x L 的洗脱液，涡旋混匀使颗粒悬浮，置水浴锅中6 5 温育1 0m i n，期间摇匀2 3 次，磁分离吸

12、取的上清液即为提取的D N A 样本。实验重复2 次。将提取的核酸样本进行琼脂糖凝胶(1 0 L)电泳，用N a n o D r o p2 0 0 0 超微量紫外可见分光光度计进行产量和浓度检测。1 4 4 煮沸法血清D N A 提取在1 5m LE P 管中加1 0 0I x L 血清和2 0 斗L 裂解液(同磁珠法)，涡旋混匀，煮沸1 0m i n；50 0 0r m i n 离心5m i n，轻轻吸取上清液于另一清洁的离心管中，加入2 0 斗L0 4m m o l LT r i s-H C l(p H7 5)，4 保存备用。1 4 5D N A 提取产物的P C R 验证分别对磁性颗粒提

13、取法和煮沸裂解法提取的D N A 样本进行P C R扩增。采用B l a s t 和C l u s t aW 软件比对分析，参照H B V 的x 蛋白编码基因的部分区段并稍作修改，设计一对H B VD N A 特异性引物，扩增片段大小约为1 2 0b p，正向弓I 物序列：5 一c c G T C T G T G c C T T c T C A TC T G 37，反向弓I 物序列：57 一A G T C C A A G A G T T C T C T T AT G C A A G A C C T Y 37，由上海生工公司合成。P C R 扩增体系为2 0 止，成分主要包括1 0 T a q

14、酶缓冲液(不含M 9 2+)2I x L，1 5m m o l LM g C l 20 8 弘L，2 5 0m o l Ld N T P s0 5 灿L，0 5 斗m o l L 上、下游引物各1I x L，模板2 斗L 和5U< a qD N A 聚合酶0 3止，d d H：O 补足体积。扩增条件：9 5 预变性3m i n；9 5 变性1 5s，6 0 退火6 0S，7 2o C 延伸6 0S，循环4 5 次；7 2 延伸7r a i n；4o C 保存。扩增产物用1 6g L 琼脂糖凝胶电泳检测。1 5 实时荧光定量P C R 检测H B VD N A 磁珠法与煮沸法分别提取的D N

15、 A 均用同一P C R 仪(A B I7 5 0 0 型)平行定量检测H B V 载量，扩增条件如1 4 5，采用S Y BG r e e n 荧光染料进行检测 引。1 6 统计学分析采用S P S S1 9 0 软件进行。计数资料的比较采用，检验，一致性验采用K a p p a 检验进行分析，回归方程采用双变量的线性回归，以P 0 0 5 为差异有统计学意义。2 结果2 1F e，O。磁性颗粒与F e 3 0。S i O：磁性复合颗粒的表征F e，O。磁性颗粒和F e，O。S i O：磁性复合颗粒的形状均为球形，粒径比较均匀，且分散性比较好。F e，O。磁性颗粒的粒径约为5 0 0l i

16、B，颗粒中心与外周颜色相同，可判断该颗粒为实心状；同时发现，颗粒表面呈现有更为精细的结构，该结构是由粒径极小的F e，O。磁性纳米颗粒组成。F e，O。S i O：磁性复合颗粒具有明显的核壳结构，中间黑色区域为实心F e，O。磁性颗粒，周围灰色区域为S i O：壳，厚度为5 0 8 0a m。整个磁性复合颗粒粒径主要集中在5 5 0n m 左右。见图1。2 2 磁珠法提取D N A 结果2 2 1 磁珠法提取全血D N A 经磁珠法提取全血D N A 电泳见图2。由图可知，磁性颗粒提取法所得D N A 电泳条带单一，分子量约2 30 0 0b p，无拖尾现象。说明提取的样本D N A 纯度较高。2 2 2磁珠法提取全血D N A 纯度与浓度A 2 6 0。们。值为1 5 3，略低于1 7 0，说明存在少量蛋白质污染。本研究磁性颗粒提取的全血D N A 样品浓度为1 5 0 5 6n g 斗L。万方数据临床检验杂志2 0 1 6 年3J j 第3 4 卷第3 期C h i l lJC l i nL a bS c i，M a r 2 0 1 6，V 0 1 3 4，N o 3AB口图1F