树脂法分离纯化那他霉素的工艺研究.pdf

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194中国抗生素杂志2010年3月第35卷第3期文章编号：

10018689（2010）03019403大孑L树脂法分离纯化那他霉素的工艺研究王海燕李晓露王健张丽林呖张金娟张雪霞+（华北制药集团新药研究开发有限责任公司，微生物药物国家工程研究中心，石家庄050015）摘要：

目的研究大孔吸附树脂分离纯化那他霉素发酵液的工艺，提高那他霉素成品质量，得到高纯度药用级那他霉素。

方法用HPLC检测方法，以那他霉素的洗脱率为指标，考察大孔树脂分离纯化那他霉素的吸附性能和洗脱参数。

结果那他霉素从发酵液中的最佳溶出pH值为11；分离纯化那他霉素的有效吸附剂为大孔吸附树脂HZ816，其动态吸附量为150mgmL，解吸收率在90以上，成品纯度大于98。

结论该高纯度药用级那他霉素的规模化分离纯化方法为国内首次应用，工艺简单可靠，分离效果好，适于工业化生产。

关键词：

那他霉素；大孔吸附树脂；分离纯化中图分类号：

R9781+5文献标识码：

AStudiesonseparationandpurificationofnatamycinbymacroporonsresinWangHaiyan，LiXiaolu，WangJian，ZhangLi，LinYang，ZhangJin-juanandZhangXuexia（NewDrugResearch&DevelopmentCompanyofNCPC，NationalEngineeringResearchCenterofMicrobialMedicine，Shijiazhuang050015）AbstractObjectiveThemethodthatseparationandpurificationofhighpurityNatamycinforpharmaceuticalusefromfermentationbrothbymacroporousresinswasstudiedMethodsBasedonadsorptioncapacityandelutionefficiencyofNatamycin，theconditionstoseparationandpurificationofNatamycinbymacroporousresinswereoptimizedResultsTheoptimumpHvalueforreleasingNatamycinfromthefermentationbrothwas11HZ816wasselectedastheeffectivemacroporousadsorbentforseparationandpurificationofNatamycinfromfermentationbrothThedesorptionrateofNatamycinWasover90andthepurityofthefinalproductwasover98undertheoptimalconditionsConclusion111ismethodaboutseparationandpurificationofhigh-p谢tyNatamycinforpharmaceuticalusewasdiscoveredforthefirsttimeandwaswarrantedforthecommercialprocessKeywordsNatamycin；MacroporousResin；SeparationandPurification那他霉素是多烯大环内酯类抗真菌抗生素，为白色至乳白色几乎无臭无味的结晶粉末。

分子式C33H。

，NO分子质-1勤66573。

化学结构如图1。

那他霉素是那塔尔链霉菌（Streptomycesnatalenis）、恰塔努加链霉菌（Streptomycesc口ff口刀DDgP胛s如）或褐黄孢链霉菌（StreptomycesgilvosPoreus）等微生物的次生代谢产物，从发酵液中提取纯化后获得。

那他霉素是一种高效、低毒的具有广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和藻类剂，可以用于医疗、食品、饲料、粮储防霉，特别收稿日期：

20090923基金项目：

国家科技部重大新药创制项目企业新药物孵化基地建设，项目编号2008zx0940105；国家科技部科技支撑计划项目抗生素大规模生产关键技术创新，项目编号2007BAl26807。

作者简介：

王海燕，女，生于1979年，工程师。

主要从事天然和微生物药物的分离纯化工艺研究。

通讯作者，E-mail：

zhangxuexiazxx163com万方数据大孔树脂法分离纯化那他霉素的工艺研究王海燕等是在食品原料保鲜、食品防腐等方厦具有良好的使用12o那他霉素是两性物质，分子中含有一个碱性基团和一个酸性基团，其电离常数pKa值为8-35和46，相应的等电点为65。

由于那他霉素含有4个相连的双键结构，决定了那他霉素几乎不溶于水，微溶于甲醇，溶于冰醋酸【3】。

由于那他霉素的溶解特性，很多用于那他霉素分离的工艺为溶媒提取结晶和物理分离【4，51。

这些提取过程使用的溶剂量大，损耗大，成本高，很难实现规模化生产。

本文采用大孔吸附树脂从发酵液中将目的产物分离、富集、结晶、干燥，在国内首次实现了规模化的高纯度药用级那他霉素的分离纯化，产品质量NH20HOHCH30图I那他霉素的化学结构Fig1Thestructureofnatamycin符合国家药典要求，收率稳定，设备投资少，适于工业化生产。

l仪器与材料高效液相色谱仪（996检测器，515泵，Waters公司）；Loborata4000旋转蒸发器（Heidolph公司）；PHS3c型酸度计（上海雷磁仪器厂）；TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

那他霉素发酵液（华药集团新药公司生物工程室提供）；那他霉素标准品（购自美国Sigma公司）。

大孔树脂D312、DA201、HZ816、HZS01（上海华震科技有限公司），大孔树脂AmberliteXADl6HP（美国罗门哈斯公司），大孔树脂X一5、AB8（安徽三星树脂科技有限公司），大孔树H旨HPDloo（天津海光化工有限公司）；去离子水（本实验自制）；乙腈（色谱纯，美国Merk公司）；工业乙醇（沧州兴隆化工有限公司）；其他试剂均为国产分析纯；2方法与结果21HPLC法测定那他霉素的含量色谱柱：

ExtendC18（46mmx250mm，5“m）；流动相：

乙腈水00lm01L醋酸铵缓冲溶液（70：

30）：

流速：

10mLmin；检测波长：

303nm；进样量：

lOItL。

那他霉素保留时间为92min。

22发酵液预处理及溶液pH值对那他霉素溶出率的影响221发酵液预处理由于那他霉素主要存在于菌丝体内，且发酵液中杂质较多，不利于直接进行树脂吸附。

首先在发酵液中加入7的珍珠岩，搅拌30rain后真空抽滤，水顶洗，得那他霉素菌丝体。

222溶液pH值对那他霉素洛出率的影响提高那他霉素的成品质量和成品收率，菌丝体内那他霉素的溶出率是关键因素，为此根据那他霉素的两性特征，首先考察不同pH值下那他霉素的溶出率，找到最佳溶出条件。

将那他霉素菌丝体在不同pH值的水中搅拌2h，HPLC在线检测，其最佳溶出pH值（25）见图2。

从图2中可以看出，pH接近中性和偏低时不利120100不80锝60蠡402003456789101l121314PH值图2pH对那他霉素溶出率的影响Fig2EffectofdifferentpHOildissolutionratetonatamycin于那他霉素的溶出，而pH过高对那他霉素有分解作用，本实验中确定pH为11是最佳溶出pH。

23树脂的吸附和解吸231吸附条件的考察

（1）树脂的预处理及再生：

先用丙酮充分浸泡树脂，除去色素和杂质，并用蒸馏水洗涤，至洗涤液加丙酮不变浑为止。

然后用4倍树脂体积的2molLHCI溶液搅拌浸泡4h，用蒸馏水洗至中性。

再用4倍树脂体积的2molLNaOH溶液搅拌浸泡4h，洗至中性备用。

再生的方法与预处理基本相同。

（2）树脂的筛选：

取预处理好的不同型号的大孔万方数据中国抗生素杂志2010年3月第35卷第3期吸附树脂各100mL装柱，从上端加入那他霉素菌丝体浸提滤液，流速为2BVh树脂床体积，并以HPLC在线检测出口液浓度，当出口液浓度接近上样液浓度10时，认为树脂已吸附饱和并停止上样，计算吸附容量。

根据那他霉素弱极性的特性，选用D312、DA20l、HZ816、HZ801、AmberliteXADl6HP、X5、AB8和HPD100等8种非极性大孔吸附树脂，在pH70的条件下进行动态吸附筛选，结果见图3。

由图3可以看出，AmberliteXAD