树脂法分离纯化那他霉素的工艺研究.pdf

1、1 9 4 中国抗生素杂志2 0 1 0 年3 月第3 5 卷第3 期文章编号：1 0 0 1 8 6 8 9(2 0 1 0)0 3 0 1 9 4 0 3大孑L 树脂法分离纯化那他霉素的工艺研究王海燕李晓露王健张丽林呖张金娟张雪霞+(华北制药集团新药研究开发有限责任公司，微生物药物国家工程研究中心，石家庄0 5 0 0 1 5)摘要：目的研究大孔吸附树脂分离纯化那他霉素发酵液的工艺，提高那他霉素成品质量，得到高纯度药用级那他霉素。方法用H P L C 检测方法，以那他霉素的洗脱率为指标，考察大孔树脂分离纯化那他霉素的吸附性能和洗脱参数。结果那他霉素从发酵液中的最佳溶出p H 值为1 1；分

2、离纯化那他霉素的有效吸附剂为大孔吸附树脂H Z 8 1 6，其动态吸附量为1 5 0 m g m L，解吸收率在9 0 以上，成品纯度大于9 8。结论该高纯度药用级那他霉素的规模化分离纯化方法为国内首次应用，工艺简单可靠，分离效果好，适于工业化生产。关键词：那他霉素；大孔吸附树脂；分离纯化中图分类号：R 9 7 8 1+5文献标识码：AS t u d i e so ns e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fn a t a m y c i nb ym a c r o p o r o n sr e s i nW a n gH a i y

3、a n，L iX i a o l u，W a n gJ i a n，Z h a n gL i，L i nY a n g，Z h a n gJ i n-j u a na n dZ h a n gX u e x i a(N e wD r u gR e s e a r c h&D e v e l o p m e n tC o m p a n yo f N C P C，N a t i o n a lE n g i n e e r i n gR e s e a r c hC e n t e ro f M i c r o b i a lM e d i c i n e，S h i j i a z h u a

4、 n g0 5 0 0 1 5)A b s t r a c tO b j e c t i v eT h em e t h o dt h a ts e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fh i g h p u r i t yN a t a m y c i nf o rp h a r m a c e u t i c a lu s ef r o mf e r m e n t a t i o nb r o t hb ym a c r o p o r o u sr e s i n sw a ss t u d i e d M e t h o d s

5、B a s e do na d s o r p t i o nc a p a c i t ya n de l u t i o ne f f i c i e n c yo fN a t a m y c i n，t h ec o n d i t i o n st os e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fN a t a m y c i nb ym a c r o p o r o u sr e s i n sw e r eo p t i m i z e d R e s u l t sT h eo p t i m u mp Hv a l u

6、ef o rr e l e a s i n gN a t a m y c i nf r o mt h ef e r m e n t a t i o nb r o t hw a s1 1 H Z 816w a ss e l e c t e da st h ee f f e c t i v em a c r o p o r o u sa d s o r b e n tf o rs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f N a t a m y c i nf r o mf e r m e n t a t i o nb r o t h T h

7、ed e s o r p t i o nr a t eo fN a t a m y c i nW a so v e r9 0 a n dt h ep u r i t yo ft h ef i n a lp r o d u c tw a so v e r9 8 u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s C o n c l u s i o n1 1 1 i sm e t h o da b o u ts e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fh i g h-p 谢t yN a t a m y

8、 c i nf o rp h a r m a c e u t i c a lu s ew a sd i s c o v e r e df o rt h ef i r s tt i m ea n dw a sw a r r a n t e df o rt h ec o m m e r c i a lp r o c e s s K e yw o r d sN a t a m y c i n；M a c r o p o r o u sR e s i n；S e p a r a t i o na n dP u r i f i c a t i o n那他霉素是多烯大环内酯类抗真菌抗生素，为白色至乳白色几

9、乎无臭无味的结晶粉末。分子式C 3 3 H。，N O 分子质-1 勤6 6 5 7 3。化学结构如图1。那他霉素是那塔尔链霉菌(S t r e p t o m y c e sn a t a l e n i s)、恰塔努加链霉菌(S t r e p t o m y c e sc 口f f 口刀D D g P 胛s 如)或褐黄孢链霉菌(S t r e p t o m y c e sg i l v o s P o r e u s)等微生物的次生代谢产物，从发酵液中提取纯化后获得。那他霉素是一种高效、低毒的具有广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和藻类剂，可以用于医疗、食品、饲料、粮储防霉，特别收稿日期

10、：2 0 0 9 0 9 2 3基金项目：国家科技部重大新药创制项目企业新药物孵化基地建设，项目编号2 0 0 8 z x 0 9 4 0 1 0 5；国家科技部科技支撑计划项目抗生素大规模生产关键技术创新，项目编号2 0 0 7 B A l 2 6 8 0 7。作者简介：王海燕，女，生于1 9 7 9 年，工程师。主要从事天然和微生物药物的分离纯化工艺研究。通讯作者，E-m a i l：z h a n g x u e x i a z x x 1 6 3 c o m万方数据大孔树脂法分离纯化那他霉素的工艺研究王海燕等是在食品原料保鲜、食品防腐等方厦具有良好的使用1 2 o那他霉素是两性物质，分

11、子中含有一个碱性基团和一个酸性基团，其电离常数p K a 值为8-3 5 和4 6，相应的等电点为6 5。由于那他霉素含有4 个相连的双键结构，决定了那他霉素几乎不溶于水，微溶于甲醇，溶于冰醋酸【3】。由于那他霉素的溶解特性，很多用于那他霉素分离的工艺为溶媒提取结晶和物理分离【4，5 1。这些提取过程使用的溶剂量大，损耗大，成本高，很难实现规模化生产。本文采用大孔吸附树脂从发酵液中将目的产物分离、富集、结晶、干燥，在国内首次实现了规模化的高纯度药用级那他霉素的分离纯化，产品质量N H 20 HO HC H 30图I那他霉素的化学结构F i g 1T h es t r u c t u r eo

12、f n a t a m y c i n符合国家药典要求，收率稳定，设备投资少，适于工业化生产。l 仪器与材料高效液相色谱仪(9 9 6 检测器，5 1 5 泵，W a t e r s公司)；L o b o r a t a4 0 0 0 旋转蒸发器(H e i d o l p h 公司)；P H S 3 c 型酸度计(上海雷磁仪器厂)；T G L-1 6 G 高速离心机(上海安亭科学仪器厂)。那他霉素发酵液(华药集团新药公司生物工程室提供)；那他霉素标准品(购自美国S i g m a 公司)。大孔树脂D 3 1 2、D A 2 0 1、H Z 8 1 6、H Z S 0 1(上海华震科技有限公司

13、)，大孔树脂A m b e r l i t eX A D l 6 H P(美国罗门哈斯公司)，大孔树脂X 一5、A B 8(安徽三星树脂科技有限公司)，大孔树H 旨H P D l o o(天津海光化工有限公司)；去离子水(本实验自制)；乙腈(色谱纯，美国M e r k 公司)；工业乙醇(沧州兴隆化工有限公司)；其他试剂均为国产分析纯；2 方法与结果2 1H P L C 法测定那他霉素的含量色谱柱：E x t e n dC 1 8(4 6 m m x 2 5 0 m m，5“m)；流动相：乙腈水0 0 lm 0 1 L 醋酸铵缓冲溶液(7 0：3 0)：流速：1 0 m L m i n；检测波长

14、：3 0 3 n m；进样量：l O I t L。那他霉素保留时间为9 2 m i n。2 2发酵液预处理及溶液p H 值对那他霉素溶出率的影响2 2 1发酵液预处理由于那他霉素主要存在于菌丝体内，且发酵液中杂质较多，不利于直接进行树脂吸附。首先在发酵液中加入7 的珍珠岩，搅拌3 0 r a i n 后真空抽滤，水顶洗，得那他霉素菌丝体。2 2 2溶液p H 值对那他霉素洛出率的影响提高那他霉素的成品质量和成品收率，菌丝体内那他霉素的溶出率是关键因素，为此根据那他霉素的两性特征，首先考察不同p H 值下那他霉素的溶出率，找到最佳溶出条件。将那他霉素菌丝体在不同p H 值的水中搅拌2 h，H P

15、 L C 在线检测，其最佳溶出p H 值(2 5)见图2。从图2 中可以看出，p H 接近中性和偏低时不利1 2 01 0 0不8 0锝6 0蠡4 02 003 456 7891 01 l1 2 1 3 1 4P H 值图2p H 对那他霉素溶出率的影响F i g 2E f f e c to fd i f f e r e n tp HO i ld i s s o l u t i o nr a t et on a t a m y c i n于那他霉素的溶出，而p H 过高对那他霉素有分解作用，本实验中确定p H 为1 1 是最佳溶出p H。2 3 树脂的吸附和解吸2 3 1 吸附条件的考察(1)

16、树脂的预处理及再生：先用丙酮充分浸泡树脂，除去色素和杂质，并用蒸馏水洗涤，至洗涤液加丙酮不变浑为止。然后用4 倍树脂体积的2 m o l LH C I 溶液搅拌浸泡4 h，用蒸馏水洗至中性。再用4 倍树脂体积的2 m o l LN a O H 溶液搅拌浸泡4 h，洗至中性备用。再生的方法与预处理基本相同。(2)树脂的筛选：取预处理好的不同型号的大孔万方数据中国抗生素杂志2 0 1 0 年3 月第3 5 卷第3 期吸附树脂各1 0 0 m L 装柱，从上端加入那他霉素菌丝体浸提滤液，流速为2 B V h 树脂床体积，并以H P L C在线检测出口液浓度，当出口液浓度接近上样液浓度1 0 时，认为树脂已吸附饱和并停止上样，计算吸附容量。根据那他霉素弱极性的特性，选用D 3 1 2、D A 2 0 l、H Z 8 1 6、H Z 8 0 1、A m b e r l i t eX A D l 6 H P、X 5、A B 8 和H P D 1 0 0 等8 种非极性大孔吸附树脂，在p H 7 0 的条件下进行动态吸附筛选，结果见图3。由图3 可以看出，A m b e r l i t eX A D