各种微生物生化试验方法原理 2.docx
《各种微生物生化试验方法原理 2.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《各种微生物生化试验方法原理 2.docx（14页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
各种微生物生化试验方法原理2
各种微生物生化试验方法原理
通常利用生化试验的方法，检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物，称为细菌的生化反响，常用于细菌的鉴别。
1、糖类分解产物
〔1〕糖发酵试验〔carbohydratefermentationtest〕不同种类的细菌对糖的分解利用才能不同，一般以能否分解某种糖，是否产酸产气等现象来鉴别。
例如大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖，产酸且产气；而伤寒杆菌只分解葡萄糖产酸不产气，且不分解乳糖。
这是因为大肠杆菌分解葡萄糖等产生甲酸，经甲酸解氢酶的作用生成H2和CO2。
而伤寒杆菌无此酶，故分解葡萄糖只产酸不产气。
〔2〕VP试验〔Voges-Proskauertest〕产气杆菌将分解葡萄糖产生的两分子丙酮酸脱羧，生成一分子乙酰甲基甲醇。
乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中氧气氧化，生成二乙酰，二乙酰可与培养液中含胍基的化合物〔如蛋白胨中的精氨酸〕反响，生成红色的化合物，此为VP试验阳性。
大肠杆菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇，故VP试验阴性。
〔3〕甲基红试验〔methylredtest〕大肠杆菌和产气杆菌均属G-短杆菌，且都能分解葡萄糖、乳糖产酸产气，二者不易区别。
但两者所产生的酸类和总酸量不一：
大肠杆菌可产生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，而产气杆菌只产生甲酸、乙醇及乙酰甲基甲醇。
故大肠杆菌培养液PH在4.5以下，参加甲基红指示剂呈红色，为甲基红试验阳性；产气杆菌培养液PH在5.4以上，参加甲基红后呈桔黄色，为甲基红试验阴性。
〔4〕枸橼酸盐利用试验（citrateutilizationtest〕产气杆菌在以枸橼酸盐为唯一碳源的培养基上生长，分解枸橼酸盐产生CO2，并转变为碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，含溴麝香草酚蓝〔BTB〕指示剂的培养基由淡绿色变为深兰色，此为枸橼酸盐利用试验阳性。
大肠杆菌不能利用枸橼酸盐，故在此培养基上不能生长，培养基仍为绿色。
2、蛋白质及氨基酸的分解产物
〔1〕硫化氢试验〔hydrogensulfidetest〕有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸〔如胱氨酸、甲硫氨酸等〕产生H2S，如遇醋酸铅或硫酸亚铁，能生成黑色的硫化物，为硫化氢试验阳性。
本试验常用于区别肠道杆菌的种类。
沙门氏菌属通常为阳性;大肠杆菌、产气杆菌、志贺氏菌为阴性。
〔2〕明胶液化试验〔gelatinliguefactiontest〕有些细菌具有明胶酶，能分解明胶使其失去凝固才能而液化。
变形杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌、枯草杆菌等能液化明胶；大肠杆菌、沙门氏菌那么不能。
〔3〕吲哚试验〔indoletest〕有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成无色吲哚，参加对-二甲基氨基苯甲醛，无色吲哚生成红色玫瑰吲哚，
为吲哚试验阳性。
大肠杆菌、霍乱弧菌等吲哚试验阳性；产气杆菌、伤寒沙门氏菌为吲哚试验阴性。
吲哚对二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚
细菌的生化反响是鉴别细菌的重要手段：
其中吲哚试验〔I〕、甲基红试验〔M〕、VP试验（V）和枸橼酸盐利用试验〔C〕，简称为IMVIC试验，常用于大肠杆菌与产气杆菌的鉴别。
典型的大肠杆菌的IMViC试验结果为“++--〞，而产气杆菌是“--++〞。
0票票数
实验四、微生物的快速鉴定和自动化分析技术
如何使微生物学技术方法快速、准确、简易和自动化，一直是微生物学工作者研究的热点，尤其是临床医学方面，对微生物的快速准确鉴定，更是"时间就是生命"。
近20多年来，随着微电子、计算机、分子生物学、物理、化学等先进技术向微生物学的浸透和多学科的穿插，这方面已获得了打破性进展，许多快速、准确、敏感、简易、自动化的方法技术，不仅在微生物鉴定中广为使用，而且在微生物学的其它方面也被采用，推动了微生物学的迅速开展。
一、微量多项试验鉴定系统
该系统的根本原理是根据微生物生理生化特征鉴定的结果，而进展的数码分类鉴定。
这种技术也称为简易诊检技术，或数码分类鉴定法。
它是针对微生物的生理生化特征，配制各种培养基、反响底物、试剂等，分别微量〔约0.1ml〕参加各个分隔室中〔或用小圆纸片吸收〕，冷冻枯燥脱水或不枯燥脱水，各分隔室在同一塑料条或板上构成检测卡。
试验时参加待检测的某一种菌液，培养2~48小时，观察鉴定卡上各项反响，按断定表断定试验结果，用此结果编码，查检索表（根据数码分类鉴定的原理编制成），得到鉴定结果，或将编码输入计算机，用根据数码分类鉴定原理编制的软件鉴定，打印出结果。
微量多项试验鉴定系统已广泛用于动、植物检疫、临床检验、食品卫生、药品检查、环境监测、发酵控制、生态研究等方面，尤其是临床检验中深受欢迎，迅猛开展。
国际上此技术的产品，或称系统，种类繁多，国内有河南开封医学生物研究所的肠杆菌科细菌鉴定卡E-15；上海市卫生防疫站的发酵性革兰氏阴性杆菌鉴定系统SWF-A；中国人民解放军一八一医院的厌氧菌快速生化鉴定系列ARB-ID；深圳华士达生物科技的肠杆菌科的细菌生化鉴定卡ENT等。
国外的产品已标准化、系统化和商品化，主要有法国生物-梅里埃集团的API/ATB；瑞士罗氏公司的Micro-ID，Enterotube,Minitek；美国的Biolog全自动和手动细菌鉴定系统：
日本的微孔滤膜块等，其中API/ATB包括众多的鉴定系统，共计有750种反响，可鉴定几乎所有常见的细菌。
微量多项鉴测技术优点突出，不仅能快速、敏感、准确、重复性好地鉴检微生物，而且简易，节省人力、物力、时间和空间，缺点是各系统差异较大，有的价格贵，有的个别反响不准，难断定，但毫无疑问，它是微生物技术方法向快速、简易和自动化开展的重要方向之一。
API20E系统是API/ATB中最早和最重要的产品，也是国际上应用最多的系统。
该系统的鉴定卡是一块有20个分隔室的塑料条，分隔室由相连通的小管和小环组成，各小管中含不同的脱水培养基、试剂，或底物等，每一分隔室可进展一种生化反响，个别的分隔室可进展两种反响，主要用来鉴定肠杆菌科细菌，如图1所示。
图1API20E鉴定卡示意图
鉴定未知细菌的主要过程：
将菌液参加每一个分隔室；培养后，有的分隔室的小杯中需要添加试剂，观察鉴定卡上20个分隔室中的反响变色情况，根据反响断定表〔表1〕，断定各项反响是阳性还是阴性反响；按鉴定卡上反响工程从左到右的顺序，每三个反响工程编为一组，共编为七组，每组中每个反响工程定为一个数值，依次是1、2、4，各组中试验结果断定的反响是阳性者记"＋"，那么写下其所定的数值，反响阴性者记"－"，那么写为0，每组中的数值相加，便是该组的编码数，这样便形成了7位数字的编码，表2为举例说明；用7位数字的编码查API20E系统的检索表，或输入计算机检索，那么能将检验的细菌鉴定出是什么菌种或生物型。
表1 API20E反响断定表
鉴定卡上的反响工程
反应结果
代号
项目名称
阴性
阳性
ONPN
β-半乳糖苷酶
无色
黄
ADH
精氨酸水解
黄绿
红，橘红
LDC
赖氨酸脱羧
黄绿
红，橘红
ODC
鸟氨酸脱羧
黄绿
红，橘红
CIT
枸椽酸盐利用
黄绿
绿蓝
H2S
产H2S
无色
黑色沉淀
URE
尿素酶
黄
红紫
TDA
色胺酸脱氨酶
黄
红紫
IND
吲哚形成
黄绿
红
VP
无色
红
GEL
蛋白酶
黑粒
黑液
GLU
葡萄糖产酸
蓝
黄绿
MAN
甘露醇产酸
蓝
黄绿
INO
肌醇产酸
蓝
黄绿
SOR
山梨醇产酸
蓝
黄绿
RHA
鼠李糖产酸
蓝
黄绿
SAC
蔗糖产酸
蓝
黄绿
MEL
密二糖产酸
蓝
黄绿
AMY
淀粉产酸
蓝
黄绿
ARA
阿拉伯糖产酸
蓝
黄绿
表2API20E举例说明
工程名称
ONPG
ADH
LDC
ODC
CIT
H2S
URE
TDA
IND
VP
GEL
GLU
MAN
INO
SOR
RHA
SAC
MEL
AMY
ARA
所定数值
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
试验结果
+
-
+
+
+
-
-
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
记下数值
1
0
4
1
2
0
0
0
0
1
0
4
1
2
4
1
2
4
1
2
编 码
5
3
0
5
7
7
3
检索结果
5305773产气肠杆菌〔Enterobacteraerogenes〕
实验五、抗微生物药物敏感性试验
一、实验目的
抗微生物药物敏感性试验〔药敏试验〕的主要目的检出细菌的耐药性，预测抗微生物药物的临床治疗效果，并为临床医生针对某一特定的临床感染选用药物提供根据。
对所有临床别离的可疑致病菌，如不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，就需要进展药敏试验。
纸片扩散法
二、实验原理
此法是临床和实验室标准化研究所〔CLSI/NCCLS〕所推荐的临床微生物理学室常规开展的药敏试验方法。
将含有定量抗菌药物的纸片〔药敏纸片〕贴在已接种待检菌的琼脂平板外表特定部位。
药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片间隔加大，琼脂中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。
其纸片周围一定区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓度时，那么该区域内细胞不能生长，形成透明抑制圈。
抑菌圈的大小可以反映待检对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度〔MIC〕呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
三、实验器材和试剂
1．菌种 金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853或临床别离的菌株。
2．培养基 MH〔Mueller-Hintion〕琼脂。
3．试剂 无菌生理盐水，0.5麦氏标准比浊管〔McFarland
standard，相当于1.5×108CFU/ml〕，抗菌药物纸片：
选用直径6.35mm吸水量20μl的专用药敏纸片，包括阿米卡星〔AMK〕、青霉素〔PEN〕、氨苄西林〔AMP〕、哌拉西林〔PIP〕、头孢唑啉〔FZN〕、头孢呋辛〔FRX〕、头孢他啶〔CAZ〕、头孢他啶/棒酸〔CD03〕、氨曲南〔ATM〕、亚胺培南〔IMP〕、环丙沙星〔CIP〕、万古霉素〔VAN〕、克林霉素〔CLI〕、复方新诺明〔SXT〕。
4．其他 无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。
四、方法步骤
1．菌液制备
〔1〕对数生长法：
从琼脂平板上选取至少3-5个形态特征一致的菌落，用接种环转移至含4~5ml的肉汤培养管〔如胰酶消化大豆肉汤〕中，35℃孵育2-6h。
用无菌盐水或肉汤调整菌液浊度相当于0.5麦氏标准。
〔2〕直接菌落法：
从孵育18-24h的非选择性培养基〔如血琼脂〕平板上，挑取单个菌落，直接用肉汤或无菌盐水制成0.5麦氏标准浊度的悬液。
2．接种 细菌悬液制备后15min内接种至MH琼脂平板。
用无菌棉拭醮取菌悬液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，最后沿平板内缘涂抹一周。
3．贴药敏纸片
涂布后的平板在室温下枯燥3-5min，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂外表并轻压，使纸片与琼脂外表完成接触。
各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再挪动位置。
4．孵育
将平板倒置放入35℃孵箱〔苛养菌敏平板应放置于5%-10%CO2环境中〕，16-18h读取结果，葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。
五、结果判断
抑菌圈的直径〔包含纸片的直径〕，以毫
升级会员 