第五部分和第六部分液体奶和奶品微生物检验方法.docx

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第五部分和第六部分液体奶和奶品微生物检验方法

第五部分液体奶微生物检验方法

一、菌落总数的测定……………………………………………第134页

二、大肠菌群的测定……………………………………………第134页

三、芽孢耐热芽孢检验…………………………………………第134页

四、霉菌、酵母菌的检测………………………………………第134页

五、乳酸菌的检测………………………………………………第138页

六、嗜冷菌的检测………………………………………………第139页

七、牛乳美兰还原试验…………………………………………第139页

八、致病菌检验……………………………………………第140页

（一）蜡样芽孢杆菌……………………………………………第140页

（二）沙门氏菌…………………………………………………第145页

（三）金黄色葡萄球菌…………………………………………第156页

九、涂抹检验……………………………………………………第159页

十、空气净度检验………………………………………………第159页

十一、水样检测………………………………………………第159页

十二、无菌奶的检验……………………………………………第159页

十三、半成品的检验……………………………………………第160页

十四、乳制品中乳酸菌益生菌的测定…………………………第160页

十五、志贺氏菌的检验…………………………………………第162页

十六、微生物鉴定………………………………………………第170页

十七、小样发酵法的操作规程…………………………………第175页

一、菌落总数的测定:

同冰淇淋微生物检验方法,见116页.

二、大肠菌群的测定：

同冰淇淋微生物检验方法,见109页.

三、芽孢耐热芽孢检验

细菌特殊形态：

1芽孢：

细菌生长到后期的一种形态（营养不良造成）细胞浓缩形成。

2荚膜：

3鞭毛：

有动力性，用穿刺法（半固体）测

芽孢：

一些细菌在其生长后期，在胞内形成一个抗逆性，（热、干燥、压力等）特别强的圆形或椭圆状的原壁厚密的内生孢子称为芽孢。

培养基：

锰盐营养琼脂:

每1000ML普通营养琼脂中加硫酸锰（3.08gMnSO4+100mlH2O）1ml（注：

现化验室用直接配制好的锰盐营养琼脂混合物，30g加入1000ml煮沸的蒸馏水中，混匀，溶解。

）

（一）芽孢总数测定

A、样品准备

1.在无菌操作条件下，将10ml室温状态下的待检样品加入一个灭菌试管中，盖好棉塞。

2.在同直径的试管中加入10ml同样室温状态下的水，并插入温度计。

3.将上述两支试管同时放入水浴中保温，待温度计温度升至80℃时开始计时。

4.计时达10分钟后，迅速将样品管取出，置于冷水中迅速降温至室温。

5.按无菌操作条件对降温后的样品进行稀释，编号后记录在“微生物检验操作表”中。

显示目录料选取10﹣-2至10﹣-4三个稀释度的样品稀释液。

中间产品检验选取10﹣-1至10﹣-2两个稀释度的样品稀释液。

问题产品检验选取10﹣-1至10﹣-2两个稀释度的样品稀释液。

B、培养基准备

1.检查预先经过灭菌处理的锰盐营养琼脂培养基是否处于正常、可用状态。

2.将高压灭菌后的培养基，冷至45℃左右待用。

C、接种培养

1.在无菌操作条件下，在一个灭菌平皿内倾入15ml锰盐营养琼脂培养基，并暴露至接种过程结束，标记后以作为环境对照样品。

2.按样品编号在灭菌平皿底部作相应标记，并记录在“微生物检验操作表”中。

3.在无菌操作条件下，用1ml的灭菌吸管移取1ml选定的样品稀释液或样品原样至灭菌平皿内。

4.同上对同一样品重复操作。

即每个选定的样品稀释度做两个平皿。

5.按以上步骤，以1毫升无菌生理盐水作为空白操作对照。

6.在无菌操作条件下，将约15ml的锰盐营养琼脂培养基倾入样品平皿中，将平皿置于操作台面上轻轻转动，使样品和培养基混合均匀。

7.待琼脂凝固后，将平皿翻转，即保持有标记和培养基的一面向上。

8.将所有平皿（包括空白和环境对照）置于36±1℃的恒温培养箱内，保温培养60---62小时。

9.在“微生物检验操作表”中记录保温时间。

D、菌落计数

1.计数原则同菌落总数。

计数时认准芽孢菌落，必要时要镜检。

记录在“微生物检验操作表”中。

2.检验结果=平行样品菌落数之和/2x稀释倍数。

记录在“微生物检验操作表”中。

3.计数结果在100以内，按实际计数报告；100至10000的，按两位有效数字报告，如果样品只做原液时计数结果在100以外，按实际计数报告。

（二）耐热芽孢总数测定

A、样品准备

1.在无菌操作条件下，将10ml室温状态下的待检样品加入一个灭菌试管中，盖好棉塞。

2.在同直径的试管中加入10ml同样室温状态下的水，并插入温度计。

3.将上述两支试管同时放入水浴中保温，待温度计温度升至100℃开始计时。

4.计时达10分钟后，迅速将样品管取出，置于冷水中迅速降温至室温。

5.按无菌操作条件对降温后的样品进行稀释，编号后记录在“微生物检验操作表”中。

显示目录料选取10﹣-2至10﹣-4三个稀释度的样品稀释液。

中间产品检验选取10﹣-1至10﹣-2两个稀释度的样品稀释液。

问题产品检验选取10﹣-1至10﹣-2两个稀释度的样品稀释液。

B、培养基准备

1.检查预先经过灭菌处理的锰盐营养琼脂培养基是否处于正常、可用状态。

2.将高压灭菌后的培养基，冷至45℃左右待用。

C、接种培养

1.在无菌操作条件下，在一个灭菌平皿内倾入约15ml锰盐营养琼脂培养基，并暴露至接种过程结束，标记后以作为环境对照样品。

2.按样品编号在灭菌平皿底部作相应标记，并记录在“微生物检验操作表”中。

3.在无菌操作条件下，用1ml的灭菌吸管移取1ml选定的样品稀释液或样品原样至灭菌平皿内。

4.同上对同一样品重复操作。

即每个选定的样品稀释度做两个平皿。

5.按以上步骤，以1毫升无菌生理盐水作为空白操作对照。

6.在无菌操作条件下，将约15ml的锰盐营养琼脂培养基倾入样品平皿中，将平皿置于操作台面上轻轻转动，使样品和培养基混合均匀。

7.待琼脂凝固后，将平皿翻转，即保持有标记和培养基的一面向上。

8.将所有平皿（包括空白和环境对照）置于55±1℃（注：

培养温度针对特殊情况可以特殊对待，但各处统一）的恒温培养箱内，保温培养60---62小时。

9.在“微生物检验操作表”中记录保温时间。

D、菌落计数

计数原则同菌落总数。

计数时认准耐热芽孢菌落，必要时要镜检。

记录在“微生物检验操作表”中。

检验结果=（平行样品菌落数之和/2）×稀释倍数。

记录在“微生物检验操作表”中。

计数结果在100以内，按实际计数报告；100至10000的，按两位有效数字报告样品只做原液时计数结果在100以外，按实际计数报告。

四、霉菌、酵母菌的检测（依据国标GB/T4789.15-2003）

（一）概念：

指食品检样中经过处理，在一定条件下培养所得的1g或者1ml检样所得的霉菌、酵母菌的菌落总数。

（二）培养基：

虎红营养琼脂（孟加拉红培养基）:

蛋白胨5g

葡萄糖10g

磷酸二氢钾1g

硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5g

琼脂20g

1/3000孟加拉红溶液100ml

蒸馏水1000ml

氯霉素0.1g

将上述各成分加入蒸馏水溶解后，再加孟加拉红溶液。

另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装1210C灭菌20min。

（注：

现化验室用直接配制好的虎红营养琼脂混合物，30g加入1000ml煮沸的蒸馏水中，溶解。

）

（三）检测步骤：

1.样品处理：

（1）以无菌操作用称取试样25ml（g）样液注入含有225ml灭菌水的具塞锥形瓶中，即为1：

10稀释液。

（1）用灭菌吸管吸取1：

10稀释液10ml注入灭菌试管中，另用1ml灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。

（2）用灭菌吸管吸取1：

10稀释液1ml注入含有9ml灭菌水的试管中，即为1：

100稀释液。

（3）按上述操作做10倍递增稀释液每稀释一次换一根1ml吸管。

2.接种培养：

（1）选择三个（样品中霉菌酵母菌含量极少时也可选两个，但需要保留相应对比数据）合适稀释度，用无菌管吸取1ml于灭菌平皿中，每个稀释度作2个平皿。

（2）将凉至45。

C左右的虎红营养琼脂培养基注入平皿中约15ml，待凝固后，倒置于25—28。

C培养箱中，3天后观察镜检，共培养观察5天。

3.计算方法:

（1）菌落形态：

A霉菌：

毛状，蜘蛛网状，棉絮状，有多种颜色。

B酵母菌：

菌落光滑湿润，白或乳白色，较大，时间长表面有皱缩。

（2）记数：

通常选择菌落数在10---150之间的平皿进行计数,同稀释度的两个平皿的菌落平均数乘以稀释倍数,即为每克（或毫升）检样中所含霉菌和酵母菌.稀释度选择和菌落报告方式可参考GB/T4789.2-2003。

五、乳酸菌的检测（依据国标GB/T4789.35-2003）

（一）定义：

指一群分葡萄糖，乳糖产生乳酸，需氧或兼性厌氧，无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性无芽孢杆菌，球菌。

作用：

1.刺激胃肠分泌活动

2.增加胃肠蠕动

3.胃肠酸碱平衡

4.抑制胃肠道腐败菌的生长

5.预防、治疗胃肠道病

种类：

乳酸链球菌，乳酸杆菌

（二）培养基：

1.改良MC培养基:

大豆蛋白胨5g葡萄糖20g

酵母浸膏5g乳糖20g

牛肉浸膏5g碳酸钙10g

琼脂15g1%中性红溶液5ml

硫酸多粘菌素B（酌情而加）10万IU蒸馏水1000ml

将前七种成分加入蒸馏水中，加热溶解，调PH=6，加入中性红溶液。

分装烧瓶，高压灭菌1210C15-20min。

临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，酌情加或不加硫酸多粘菌素B（检样有胖听或开罐后有异味等疑有杂菌污染时，可加多粘菌素B，混匀后使用）。

（注：

现化验室用直接配制好的改良MC混合物，72g加入1000ml煮沸的蒸馏水中，溶解。

）

2.改良番茄汁培养基:

（改良TJA培养基）

番茄汁50ml葡萄糖2g

酵母抽取液5g乳糖20g

牛肉膏10g磷酸氢二钾2g

琼脂15g吐温501g

乙酸纳5g蒸馏水1000ml

调PH=6.8±0.21210C灭菌15-20min。

（一）检测步骤：

1.样品处理和接种培养：

基本同于菌落总数的检测，不同的是选择2-3个适宜稀释度，所用培养基是凉至45。

C左右的改良MC培养基，待凝固后，倒置于36。

C+1的培养箱中，培养72+3小时后计数。

2.菌落形态：

皿底呈粉红色，菌落呈红色，较小，菌落边缘有乳晕圈。

菌态

改良TTA

改良MC

杆菌

平四底黄色，菌落中均大小，微白色，湿润，边缘不太齐，φ3mm±1mm,棉絮状。

平四底粉红色，菌落较小,圆形,红色，边缘似星状。

φ2mm±1mm,周边有淡晕环

球菌

四底黄色，菌落光滑。

湿润，微白色，边缘整齐

四底粉红色，菌落较小圆形红色，边缘整齐，有淡晕环

（五）菌落计数：

1.选30——300间的平板计数，同菌落总数。

2.选5个菌落作证实试验

革兰氏染色G+无芽胞过氧化氢酶G—观察是否淡晕环

3.计算：

35取5个有4个相同35×4/5=28再乘以稀释倍有选举权报数。

六、嗜冷菌的检测：

同冰淇淋微生物检验方法,见119页。

七、牛乳美兰还原试验（依据国标GB6914-1986）

（一）．原理

牛奶中的微生物分泌出还原酶，使美兰还原而褪色，还原反应的速度和所存在的细菌数量有关，根据美兰退色的时间估计牛乳中的细菌总数来评定牛乳的品质。

注：

亚甲蓝的配制：

1.GB6914-19