植物基因组DNA提取试剂盒的制备与 优化.docx

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植物基因组DNA提取试剂盒的制备与优化

哈尔滨学院本科毕业论文（设计）

题目：

植物基因组DNA提取试剂盒的制备与

优化

院（系）

理学院

专业

生物科学

年级

09—1班

姓名

赵建丰

学号

09051126

指导教师

郑茂波

职称

副教授

2013年6月13日

承诺书

本人赵建丰，哈尔滨学院理学院，

生物科学专业09—1班学生，学号：

09051126。

本人郑重承诺：

本人撰写的毕业论文：

《植物基因组DNA提取试剂盒的植制备与优化》，

是个人的研究成果，数据来源真实可靠，无剽窃行为。

承诺人赵建丰

2013年6月13日

论文类型：

理工类

评语：

指导教师（签字）

年月日

评语及评分

成绩：

答辩委员会主席（签字）

年月日

院（系）学位评定委员会意见：

签字：

年月日

学校学位评定委员会意见：

签字：

年月日

毕业论文（设计）评语及成绩

目录

摘 要2

ABSTRACT3

第一章前 言4

1.1DNA提取的基本原理与意义4

1.2DNA提取方法4

1.3硅胶膜对DNA选择性吸收的原理与影响因素5

1.4试剂盒的发展情况及优势10

1.5本文的目的与意义10

第二章 材料与方法11

2.1材料11

2.1.1植物材料11

2.1.2试剂与耗材11

2.1.3设备与仪器11

2.2方法12

2.2.1试剂盒的组成12

2.2.2试剂盒组成溶液的配制12

2.3提取步骤14

2.4检测方法15

第三章　结果与分析16

结论17

参考文献18

致 谢19

摘 要

DNA是最重要的遗传物质，因此,DNA的提取方法和技术是生物化学及分子生物学最基本的技术,也是生物工程最常用的技术。

提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所必需的条件。

本文根据植物基因组DNA提取原理，设计了离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒，经过大豆、小麦、棉花和水稻等不同植物材料基因组DNA提取结果的完整性和纯度的检测，证明该试剂盒合适多种植物基因组DNA的提取，并且有较好的效果，能在实验室中推广。

关键词：

植物DNA提取；提取方法；试剂盒；DNA纯度

ABSTRACT

DNAisthemostimportantgeneticmaterial,therefore,DNAextractionmethodandtechnologyofBiochemistryandmolecularbiologyofthemostbasic,isalsothemostcommonlyusedtechnologyofbiologicalengineering.PurityandstructuralintegrityoftheextractedDNAwasstudiedintheconditionsnecessaryforthegeneengineering.AccordingtothegenomicDNAextractionprinciple,designofcentrifugalcolumntypeplantgenomicDNAextractionkit,integrityandpuritydetectionresultsaftersoybean,wheat,extractionofcottonandriceindifferentplantmaterialsforgenomicDNAextractionkit,provetheappropriateplantgenomeDNAvariety,andhasgoodeffect,canbeextendedinthelaboratory.

Keywords:

PlantDNAextraction;extractionmethod;kit;DNApurity

第一章前 言

DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象。

自20世纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋模型以来，分子生物学在广度和深度上都获得空前的发展，DNA作为分子生物学研究的基础，在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深入，在此基础上产生的基因工程技术已在医药、农业、畜牧业等领域获得广泛应用，DNA的提取是分子生物学研究的基础技术，因此，提取的DNA得纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所必须的条件。

而DNA提取试剂盒的出现，满足了快速、方便和大通量的提取需求。

1.1DNA提取的基本原理与意义

简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。

裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。

经典的裂解液几乎都含有去污剂（如SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20等）和盐（如Tris、EDTA、NaCl等）。

盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境（如Tris），还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏（如EDTA）、维持核酸结构的稳定（如NaCl）等。

去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。

裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。

也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂（如GIT、GuHCl等）裂解的，该方法已经成为了RNA抽提的主流，却不是基因组DNA抽提的主流。

最常用的纯化方法，一是PC抽提+醇沉淀，二是介质法。

第一种方法是利用PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。

第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。

高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了PC操作的麻烦。

当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的PCR。

其它杂质–如多糖、多酚等-的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。

1.2DNA提取方法

DNA提取的方法分为介质法和非介质法，介质法包括试离心柱式提取法，磁珠法。

非介质法包括SDS（十二烷基磺酸钠）法，CTAB铵（十六烷基三乙基溴化）法。

SDS（十二烷基磺酸钠）法：

SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。

CTAB铵（十六烷基三乙基溴化）法：

CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。

离心柱式提取法：

采用特殊硅基质材料制作的可特异结合DNA的离心吸附柱，根据一定的高盐缓冲系统可高效、专一地吸附DNA、RNA的原理（在高盐、低pH值情况下吸附DNA；低盐、高pH值情况下释放DNA）。

去除植物细胞中的蛋白质、糖类等有机化合物采用漂洗液溶解、离心的方式，最后在低盐、高pH值下，用洗脱缓冲液将吸附在硅基质膜上的DNA洗脱下来，从而收集纯化DNA。

磁珠法：

依据与硅胶膜离心柱相同的原理，运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。

该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。

1.3硅胶膜对DNA选择性吸收的原理与影响因素

在水溶液中,DNA分子呈酸性，带负电；silica表面的硅-氧键水化形成硅烷醇基团（silanolgroup）也呈弱酸性，带负电，所以两者之间会产生静电排斥，不能相互结合。

除非溶液中同时存在一定浓度的阳离子，后者可以通过形成阳离子桥（cationbridge）而中和DNA和silica表面的负电荷（即静电屏蔽）并使二者结合。

大量实验数据也证明，DNA与silica结合的确需要一定浓度的阳离子（包括Na+，K+,NH4+或Mg2+等），所需最低浓度与溶液的pH和silica的种类密切相关，但一般在0.1-1M之间。

在同样条件下，常见单价阳离子促进DNA-silica结合的能力从强到弱的次序为K+，Na，NH4。

阳离子桥介导的DNA-silica结合可用下图表示：

图1-1阳离子桥介导的DNA-silica结合图

但是，最新的研究发现，DNA与silica结合的主要方式并不是阳离子桥，而是DNA磷酸基团与silica表面硅烷醇基团之间形成的氢键。

阳离子桥的作用只是降低分子间静电排斥，有利于两者接近并形成氢键而已。

DNA与silica表面形成的氢键可以用下图表示：

图1-2DNA与silica表面形成的氢键图

DNA与silica表面形成的氢键结合力比较微弱，但由于其数量巨大，还是能够使DNA牢固地吸附在silica表面。

实验数据也表明，一旦DNA与silica表面结合，用同样浓度的盐溶液不能将其洗脱。

结合的速度也比较迅速，85%的DNA能在1分钟内结合到silica表面，在饱和情况下每平方米silica表面的可结合800-1000ug的DNA，结合面积占总的表面积的30%。

与silica结合的DNA抵抗DNase降解的能力比溶液中的DNA强100多倍。

影响因素：

既然DNA与silica表面是通过盐桥和氢键结合，那末凡是影响盐桥和氢键形成的因素都会影响该结合。

现将各种因素介绍如下：

silica材料：

DNA通过其磷酸二酯键与silica结合，各种DNA的磷酸二酯键完全相同，所以DNA来源对结合几乎没有影响；但silica材料种类繁多，包括各种玻璃纤维，各种硅藻土和各种硅胶膜等等，其表面结构各不相同，吸附DNA的能力千差万别。

silica表面有三类硅烷醇基团，第一种叫孤立硅烷醇基团，它不与其他分子形成氢键，第二种叫邻位硅烷醇基团（vivinalsilanolgroup）；第三种叫对位硅烷醇基团（geminalsilanolgroup）。

它们的结构示意图如下：

图1-3硅烷醇基团图

一般说来，邻位硅烷醇基团越多，越有利于DNA与silica的结合。

天泽基因测试过多种silica材料，发现它们的DNA吸附率相差可以达到300倍左右，饱和度能达到800-1000ug/M2的只有两三种产品。

这些差异可能与silica表面各种硅烷醇基团比例不同有关，所以在设计实验和开发产品时，选用优质的silica材料十分重要。

盐浓度和盐种类：

盐浓度是影响DNA与silica结合的非常重要的因素之一，DNA与silica结合与盐浓度成正比。

盐促进DNA与silica结合的本质是促进DNA与silica的去水化反应，该反应可以用下列反应式表示：

DNA-水+silica-水中性DNA-silica复合物+游离H2O由反应式可见DNA-silica复合物和游离水都是反应产物。

根据化学平衡原理，凡是降低该反应体系中游离水浓度的因素都能促使反应向右进行，即促进DNA-silica的形成。

众所周知，盐在溶液