木瓜蛋白酶活力测定方法.docx

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木瓜蛋白酶活力测定方法

木瓜蛋白酶活力测定方法

木瓜蛋白酶活力测定方法

分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。

精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。

照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IVA），以L盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：

效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W

式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度：

As为酪氨酸对照品溶液的吸收度：

Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度，ug/ml

W为供试品重量，mg;

在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。

试剂酪蛋白溶液：

取酪蛋白1g，加L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加L枸椽酸溶液调节PH至±，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。

酶稀释液：

取无水磷酸氢二钠，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠和盐酸半胱氨酸，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节±，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:

取三氯醋酸，加醋酸钠和冰醋酸，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。

酶活力测定对照品溶液的制备:

精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。

供试品溶液的制备:

取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。

淀粉酶活力测定

实验技术2008-05-2718:

01:

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　一、目的

　　淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6

　　糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。

　　淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。

小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。

因此，淀粉酶的活性测定，具有理论和应用研究的意义。

通过本实验，学习酶活测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。

　　二、原理

　　淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-

　　酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。

不同来源的淀粉酶，性质有所不同。

植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶和

　　β-淀粉酶。

　　α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α

　　-极限糊精和少量葡萄糖。

Ca2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，

　　以下可使其钝化。

　　β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1,6

　　键时停止。

单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。

β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl—

　　等辅助因子，最适pH偏酸，与α-淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70℃保温15min

　　可使其钝化。

　　通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。

可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70

　　℃加热15min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出

　　β-淀粉酶活力。

　　淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。

还原糖作用于黄色的

　　3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-

　　硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。

以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。

　　三、仪器、试剂和材料

　　1.仪器

（1）电子顶载天平

（2）研钵

　　（3）容量瓶100mL2个

　　（4）具塞刻度试管25Ml15支

　　（5）试管8支

　　（6）吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支

　　（7）离心机

　　（8）离心管

　　（9）恒温水浴锅

　　（10）分光光度计

　　2.试剂

（1）1%淀粉溶液

（2）L氢氧化钠

　　（3）柠檬酸缓冲液称取柠檬酸，溶解后定容至1000mL，为A

　　液。

称取柠檬酸钠，溶解后定容至1000mL，为B液。

取A液与B液

　　混匀，即为之缓冲液。

　　（4）3,5-二硝基水杨酸精确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L

　　氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100Ml

　　，盖紧瓶塞，防止CO2进入。

　　（5）麦芽糖标准液（1mg/ml）称取麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100mL。

　　3.材料

　　萌发3天的小麦芽。

　　四、操作步骤

　　1.酶液提取

　　称取2g萌发3天的小麦种子（芽长1cm左右），置研钵中加少量石英砂和2m1

　　左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100m1容量瓶中，用蒸馏水定容至100m1，每隔数分钟振荡1

　　次，提取20min。

3000r／min离心l0min，转出上清液备用。

　　淀粉酶活力测定

（1）取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。

（2）于每管中各加酶液lml，在70℃士℃恒温水浴中准确加热15min，钝化β

　　-淀粉酶。

取出后迅速用流水冷却。

　　（3）在对照管中加入L氢氧化钠。

　　（4）在4支试管中各加入的柠檬酸缓冲液。

　　（5）将4支试管置另一个40℃士℃恒温水浴中保温15min，再向各管分别加入40

　　℃下预热的1％淀粉溶液2m1，摇匀，立即放入40℃恒温水浴准确计时保温5min

　　。

取出后向测定管迅速加入L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。

　　3.淀粉酶总活力测定

　　取酶液5ml，用蒸馏水稀释至100m1，为稀释酶液。

另取4支试管编号，2支为对照，2

　　支为测定管。

然后加入稀释之酶液lml。

在对照管中加入氢氧化钠。

4支试管中各加1

　　之柠檬酸缓冲液。

以下步骤重复α-淀粉酶测定第（5）步的操作，同样准备测糖。

　　4.麦芽糖的测定

（1）标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。

分别加入麦芽糖标准液（lmg/ml）0,

　　,,,,,，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达

　　，再各加3，5一二硝基水杨酸试剂，置沸水浴中加热5min。

取出冷却，用蒸馏水稀释至

　　25m1。

混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光度。

以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（

　　mg）为横坐标，绘制标准曲线。

（2）样品的测定取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml

　　具塞刻度试管中，各加入2m13,5-

　　二硝基水杨酸试剂。

以下操作同标准曲线制作。

根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。

　　（A—A0）xVT

　　五、结果处理

　　式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；

　　Ao为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（mg）；

　　B为（a十β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；

　　Bo为（a十β）淀粉酶的对照管中麦芽糖（mg）；

　　VT为样品稀释总体积（ml）；

　　VU为比色时所用样品液体积（ml）；

　　W为样品重（g）。

　　六、注意事项

（1）酶反应时间应准确计算。

（2）试剂加入按规定顺序进行。

　　七、思考题

　　1.淀粉酶活性测定原理是什么

　　2.酶反应中为什么加的柠檬酸缓冲液为什么在40℃进行保温

　　3.测定酶活力，应注意什么问题？

　一、目的

　　淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6

　　糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。

　　淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。

小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生严重的穗发芽，造成巨大损失，这是小麦种子中淀粉酶活动的结果。

因此，淀粉酶的活性测定，具有理论和应用研究的意义。

通过本实验，学习酶活测定的一般方法，巩固并熟练分光光度计的使用。

　　二、原理

　　淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-

　　酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。

不同来源的淀粉酶，性质有所不同。

植物中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶和

　　β-淀粉酶。

　　α-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α-1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α

　　-极限糊精和少量葡萄糖。

Ca2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，

　　以下可使其钝化。

　　β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α-1,6

　　键时停止。

单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。

β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要Ca2+及Cl—

　　等辅助因子，最适pH偏酸，与α-淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，70℃保温15min

　　可使其钝化。

　　通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。

可以先测定（α+β）淀粉酶总活力，然后在70

　　℃加热15min，钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶活力，用总活力减去α-淀粉酶活力，就可求出

　　β-淀粉酶活力。

　　淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与3,5-二硝基水杨酸的显色反应来测定。

还原糖作用于黄色的

　　3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的3-氨基-5-

　　硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。

以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。

　　三、仪器、试剂和材料

　　1.仪器

（1）电子顶载天平

（2）研钵

　　（3）容量瓶100mL2个

　　（4）具塞刻度试管25Ml15支

　　（5）试管8支

　　（6）吸管1mL3支，2mL12支，5mL1支

　　（7）离心机

　　（8）离心管

　　（9）恒温水浴锅

　　（10）分光光度计

　　2.试剂

（1）1%淀粉溶液

（2）L氢氧化钠

　　（3）柠檬酸缓冲液称取柠檬酸，溶解后定容至1000mL，为A

　　液。

称取柠檬酸钠，溶解后定容至1000mL，为B液。

取A液与B液

　　混匀，即为之缓冲液。

　　（4）3,5-二硝基水杨酸精确称取1g3,5-二硝基水杨酸溶于20mL1mol/L

　　氢氧化钠中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100Ml

　　，盖紧瓶塞，防止CO2进入。

　　（5）麦芽糖标准液（1mg/ml）称取麦芽糖，溶于少量蒸馏水，定容至100mL。

　　3.材料

　　萌发3天的小麦芽。

　　四、操作步骤

　　1.酶液提取

　　称取2g萌发3天的小麦种子（芽长1cm左右），置研钵中加少量石英砂和2m1

　　左右蒸馏水，研成匀浆，无损地转入100m1容量瓶中，用蒸馏水定容至100m1，每隔数分钟振荡1

　　次，提取20min。

3000r／min离心l0min，转出上清液备用。

　　淀粉酶活力测定

（1）取试管4支，标明2支为对照管，2支为测定管。

（2）于每管中各加酶液lml，在70℃士℃恒温水浴中准确加热15min，钝化β

　　-淀粉酶。

取出后迅速用流水冷却。

　　（3）在对照管中加入L氢氧化钠。

　　（4）在4支试管中各加入的柠檬酸缓冲液。

　　（5）将4支试管置另一个40℃士℃恒温水浴中保温15min，再向各管分别加入40

　　℃下预热的1％淀粉溶液2m1，摇匀，立即放入40℃恒温水浴准确计时保温5min

　　。

取出后向测定管迅速加入L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。

　　3.淀粉酶总活力测定

　　取酶液5ml，用蒸馏水稀释至100m1，为稀释酶液。

另取4支试管编号，2支为对照，2

　　支为测定管。

然后加入稀释之酶液lml。

在对照管中加入氢氧化钠。

4支试管中各加1

　　之柠檬酸缓冲液。

以下步骤重复α-淀粉酶测定第（5）步的操作，同样准备测糖。

　　4.麦芽糖的测定

（1）标准曲线的制作取25ml刻度试管7支，编号。

分别加入麦芽糖标准液（lmg/ml）0,

　　,,,,,，然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达

　　，再各加3，5一二硝基水杨酸试剂，置沸水浴中加热5min。

取出冷却，用蒸馏水稀释至

　　25m1。

混匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录吸光度。

以吸光度为纵坐标，以麦芽糖含量（

　　mg）为横坐标，绘制标准曲线。

（2）样品的测定取步骤2,3中酶作用后的各管溶液2m1,分别放入相应的8支25ml

　　具塞刻度试管中，各加入2m13,5-

　　二硝基水杨酸试剂。

以下操作同标准曲线制作。

根据样品比色吸光度，从标准曲线查出麦芽糖含量，最后进行结果计算。

　　（A—A0）xVT

　　五、结果处理

　　式中A为a-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；

　　Ao为a-淀粉酶的对照管中麦芽糖量（mg）；

　　B为（a十β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖（mg）；

　　Bo为（a十β）淀粉酶的对照管中麦芽糖（mg）；

　　VT为样品稀释总体积（ml）；

　　VU为比色时所用样品液体积（ml）；

　　W为样品重（g）。

　　六、注意事项

（1）酶反应时间应准确计算。

（2）试剂加入按规定顺序进行。

　　七、思考题

　　1.淀粉酶活性测定原理是什么

　　2.酶反应中为什么加的柠檬酸缓冲液为什么在40℃进行保温

　　3.测定酶活力，应注意什么问题？