微生物学试验目的与要求.docx
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微生物学试验目的与要求
实验二细菌生理及外界因素对细菌的影响
目的
（一）掌握细菌的分离培养技术及纯种移种法。
掌握常用热力灭菌法及紫外线消毒灭菌法。
（二）熟悉细菌各种生长现象及细菌代谢产物及物理消毒法。
（三）了解细菌的常用培养基及生物因素对细菌的影响。
内容
（一）基础培养基的制备（自学），细菌移种（部分示教及操作）
（二）细菌生长现象（示教）
（三）分离培养方法——琼脂平板划线法（操作）
（四）细菌代谢产物的检查（操作及部份示教）
（五）常用物理消毒方法（操作）
（六）生物因素对细菌的影响（示教）
一、基础培养基制备及细菌移种
（一）基础培养基制备
1．肉汤培养基：
肉汤培养基常用瘦牛肉制成，如无牛肉用牛肉膏代替。
【材料】
牛肉、氯化钠、蛋白胨、氢氧化钠、蒸馏水。
【方法】
①称除去筋膜无油脂的瘦牛肉500克，用绞肉机绞碎后加水1000毫升，搅拌均匀后放置搪瓷锅内，置冰箱过夜，除去液面上的浮油并使牛肉的水溶性养料充分地渗透出来。
②次日取出，煮沸30分钟，用纱布过滤，肉渣中液体应尽量挤净。
③肉汤中加蛋白胨10克，氯化钠5g，搅拌加热使完全溶解，并用蒸馏水补足至1000毫升。
④冷至50℃左右，用氢氧化钠校正pH至7.6左右。
⑤酸碱度调整后，加热10分钟，使肉汤中部分蛋白质及磷酸盐等因加碱与再度加热的影响，而重新凝固沉淀。
滤纸过滤，补足失水。
重新调整酸碱度。
⑥分装于烧瓶或试管，瓶口或管口加棉塞，包扎后置高压蒸汽灭菌器材内，121℃蒸汽灭菌15~20分钟。
冷却，贴好标签，置于燥凉处备用。
注：
如用牛肉膏制备肉汤培养基，配方如下：
牛肉膏0.5g
蛋白胨1g
氯化钠0.5g
蒸馏水100ml
以上各种成份混合加热溶解后，即可调整pH，分装灭菌待用。
2．肉汤琼脂固体培养基制备
加2~3克琼脂至100毫升肉汤培养基内。
加热融化，过滤，补足失水，分装于试管中。
高压蒸汽灭菌后，趁热将试管斜置，冷凝后即成琼脂斜面培养基。
或待冷至50～60℃，以无菌操作倾入灭菌的培养皿中，冷凝后即成琼脂平板。
3．肉汤琼脂半固体培养基制备
①加入琼脂0.35克至100毫升pH7.8的肉汤中，加热融化后，用脱脂棉过滤，补足失水。
②分装于小试管（10×100毫米），每管3毫升。
高压蒸汽下121℃灭菌15~20分钟后直立冷凝即成。
（二）纯种细菌接种法
1．斜面培养基接种法（示教）
【材料】
（1）菌种：
大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物。
（2）培养基：
琼脂斜面培养基。
【方法】
（1）左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种与待接种的培养基管（图2－2），使菌种管位左，培养基管位右，斜面部均应向上，勿成水平，以免管底凝结水浸润在培养基表面甚至沾湿棉塞。
（2）右手拇指和食指分别转动两管棉塞，以便接种时易于拔取。
（3）右手执持接种环（姿势与握铅笔似），在火焰中烧红灭菌，欲伸入试管内的接种杆部分亦要迅速通过火焰2~3次以烧去其表面的杂菌。
灭菌过的接种环要握持手中，勿再碰及它物。
（4）以右手手掌与小指，小指与无名指分别拔取并挟持两管棉塞，将两管管口迅速通过火焰数次灭菌。
（5）以灭菌并已冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑取菌苔少许。
退出菌种管，再伸进待接种的培养基管，自斜面底轻轻向顶蜿蜒划线或在斜面作上下涂布，慎勿划破培养基表面（图2－3）。
沾菌的接种环，进出试管时，均不应触及试管内壁。
（6）接种毕，重新烧红接种环灭菌后放下。
两管管口迅速通过火焰2~3次，塞回棉塞并以右手拇、食两指分别将两管棉塞转进至原来位置。
37℃孵育18~24小时后观察生长情况。
2．液体培养基接种法（示教）
【材料】
（1）菌种：
大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物。
（2）培养基：
肉汤培养基。
【方法】
（1）如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的肉汤管。
（2）接种环灭菌冷却后，伸入菌种管挑取少量菌苔退出菌种管，再伸入肉汤管。
在接近液面的管壁上轻轻磨研，再沾少许肉汤调和，使菌混合于肉汤中（图2－4）。
（3）接种完毕，接种环重行灭菌后放下。
塞好棉塞，37℃孵育18~24小时后观察生长情况。
3．穿刺接种法（半固体接种法）示教
【材料】
（1）菌种：
大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物。
（2）培养基：
半固体琼脂培养基。
【方法】
（1）如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的半固体琼脂培养基。
（2）右手握接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔。
垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近（但勿触及）试管底，然后循原路退出（图2－5）。
二、细菌的生长现象（示教）
【材料】
1．菌种：
大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物
枯草杆菌琼脂斜面18~24小时培养物
甲型链球菌血琼脂斜面18~24小时培养物
变形杆菌琼脂斜面18~24小时培养物
痢疾杆菌琼脂斜面18~24小时培养物
2．培养基
普通肉汤培养基、血清肉汤培养基
琼脂平板、琼脂斜面、半固体培养基
【方法】
1．将大肠杆菌、枯草杆菌分别接种于2支普通肉汤培养基；甲型链球菌接种于血清肉汤培养基，37℃孵育18~24小时后取出，观察结果。
2．将变形杆菌、痢疾杆菌分别接种于2支半固体培养37℃孵育18~24小时后取出，观察结果。
3．将大肠杆菌接种于琼脂平板及琼脂斜面培养基，37℃孵育18~24小时后取出，观察结果。
三、分离培养法——板划线法（操作）
【材料】
（1）菌种：
葡萄球菌和大肠杆菌的混合菌液。
（2）培养基：
琼脂平板。
【方法】
1．烧灼接种环，待冷（约等待1分钟左右），取一接种环混合菌液。
2．左手抓握琼脂平板培养基（皿盖留在桌上），使尽量直立，以免空气中杂菌落入，并靠近火焰周围。
右手握持沾菌的接种环在琼脂平板上端来回划线，涂成一薄膜（约占平板总面积的1／10）。
划线时使接种环面与平板表面成30~40度角轻轻接触，以腕力在平板表面作轻快的滑移动作，接种环不应嵌进培养基内。
3．烧灼接种环，以杀灭环上留剩的菌液。
待冷（环是否冷却？
可先在平板培养基的边缘空白处接触一下，若琼脂溶化表示尚未冷却，宜再稍等复试之）将环通过薄膜处作连续划线（约占平板的1／5~1／6），划毕再用火焰灭菌。
冷后作同样的划线，共计4~5次（图2-6、7）。
4．划线完毕，将琼脂平板培养基覆盖皿盖，并在培养皿底玻璃面，用记号笔
注明接种菌名，接种者姓名及班级、日期等（以后凡接种的培养皿、试管等，均要照此要求，用记号笔注明）。
将培养皿倒置放进孵育箱培养，这样可避免培养过程中凝结水自皿盖滴下，冲散菌落。
5．37℃孵育24小时后取出，观察琼脂平板表面生长的各种菌落，注意其大小、形状、边缘、表面结构、透明度、颜色等性状。
四、细菌代谢产物的检查
（一）单糖发酵试验（示教）
【原理】
不同细菌具有不同的糖分解酶，故分解各种糖后的产物也不相同，有的产酸，有的尚有气体形成，借此可鉴别各种细菌。
单糖发酵试验在肠道病原菌的鉴定中尤其重要。
单糖发酵管是将葡萄糖、乳糖或麦芽糖等加入蛋白胨水培养基内，使其最终浓度为0.75~1％，并加入一定量的指示剂及一只小倒管。
接种细菌并孵育一定时间后，若该菌具有分解某种糖的酶，分解产酸就会使指示剂变色。
如指示剂为酸性复红则变为红色；溴甲酚紫则呈黄色。
若有气体形成，则小倒管内有气泡集聚。
【材料】
1．菌种；大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌琼脂斜面。
2．培养基：
乳糖发酵管。
【方法】
将大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种于3支乳糖发酵管，37℃孵育18~24小时，取出观察并记录结果。
（二）（Voges—Proskauer）试验（操作）
【原理】
VP试验可鉴别大肠杆菌和产气杆菌。
两菌在糖代谢中，分解葡萄糖后都能产生丙酮酸；丙酮酸进一步分解形成甲酸、乙酸、乳酸等。
产气杆菌并可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇，在碱性环境下被空气中氧气氧化为二乙酰，后者与蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，此为VP试验阳性。
在试验中加入α-萘酚，可加速这个反应。
大肠杆菌不能将丙酮酸脱羧故VP阴性。
2CH3COCOOH（丙酮酸）CH3COCHOHCH3（乙酰甲基甲醇）
CH3COCHOHCH3CH3COCOCH3（二乙酰）
NH2N－C－CH3
CH3COCOCH3＋HN－C（胍）NH－C（红色化合物）＋2H2O
NH2N－C－CH3
【材料】
1．菌种：
大肠杆菌、产气杆菌斜面18~24小时培养物。
2．培养基：
葡萄糖蛋白胨水培养基。
3．40％KOH溶液（含0.3％肌酸）、6％α-萘酚酒精溶液，毛细吸管。
【方法】
1．分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支葡萄糖蛋白胨水培养基中。
2．37℃孵育48小时后取出分别加入1毫升KOH和α-萘酚溶液，摇匀。
静置桌上5~15分钟内出现红色者，为阳性反应。
（三）甲基红（M．R）试验（操作）
【原理】
本试验可鉴别大肠杆菌和产气杆菌。
产气杆菌能将两分子的丙酮酸脱羧生成一分子的中性乙酰甲基甲醇，故培养物中形成酸类较少，pH值在5.4以上。
因此加入指示剂甲基红（MethylRed）后，呈现桔黄色，此为甲基红试验阴性。
而大肠杆菌分解丙酮酸，产生酸类较多，pH在4.5或更低，故甲基红呈现红色（阳性）。
【材料】
1．菌种：
大肠杆菌、产气杆菌斜面18~24小时培养物。
2．培养基：
葡萄糖蛋白胨水培养基
3．甲基红
【方法】
1．分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支葡萄糖蛋白胨水培养基中。
2．37℃孵育2—3天取出，分别滴加甲基红试剂2~3滴后立即观察。
阳性者呈红色，阴性者呈黄色。
（四）枸橼酸盐利用试验（操作）
【原理】
枸橼酸盐培养基中仅含无机盐及唯一有机物枸橼酸盐．一般细菌能利用磷酸二氢铵作氮源，但不一定能分解枸橼酸盐取得碳源，因此根据能否利用枸橼酸盐可鉴别不同细菌。
产气杆菌可以利用枸橼酸盐作为碳源，就能在本培养基上生长，形成菌落。
且分解后，有碱性的碳酸盐生成，使培养基的pH值（原在7.0以下）升高，转为碱性，则溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。
大肠杆菌不能分解枸橼酸盐，得不到碳源，不能生长，指示剂也就不会变色，培养基仍为原来绿色。
【材料】
1．菌种：
大肠杆菌、产气杆菌斜面18~24小时培养物。
2．培养基：
枸橼酸盐培养基．
【方法】
1．分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支枸橼酸盐培养基上。
2．37℃孵育24小时后观察。
有菌苔出现，培养基颜色变为深蓝色者，是为枸橼酸盐利用试验阳性。
（五）吲哚（Indol）试验（操作）
【原理】
有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚（靛基质）。
吲哚无色不能直接察见，加入对二甲基氨基苯甲醛试剂（吲哚试剂），作用后能形成红色的玫瑰吲哚，则被肉眼所识别。
【材料】
1．菌种：
大肠杆菌、产气杆菌斜面18~24小时培养物。
2．培养基：
蛋白胨水培养基。
3．试剂：
吲哚试剂、乙醚。
【方法】
1．分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支蛋白胨水培养基中。
2．37℃孵育48小时后取出，每管加2~3滴吲哚试剂于液面上，在接触面呈玫瑰红色（环状）者为阳性；仍呈黄色者为阴性。
若颜色不明显，可加4~5滴乙醚至培养物中，摇匀，使乙醚分散至培养物中。
将培养物静置桌上，待乙醚小滴上升至培养物液面后，再加吲哚试剂，这样，若培养液内有吲哚存在，就可被取而集中在乙醚层中，遇到试剂后颜色反应较明显。
（六）尿素分解试验（示教）
【原理】
有的细菌具有尿素酶，能分解尿素形成大量的氨，使培养基pH值上升而变成碱性，使酚红指示剂呈现红色，是为阳性反应。
【材料】
1．菌种：
变形杆菌、痢疾杆菌斜面18~24小时培养物。
2．培养基：
尿素培养基。
【方法】
1．分别接种变形杆菌、痢疾杆菌于尿素培养基中。
2．37℃孵育18~24小时后观察结果。
（七）硫化氢试验（示教）
【原理】
某些细菌能分解培养基中胱氨酸等含硫氨基酸，生成硫化氢。
硫化氢遇铁（如硫酸亚铁）或铅离子，则形成黑褐色的硫化亚铁（或硫化铅）沉淀物，黑色沉淀物愈多，表示生成的硫化氢量愈多，硫化氢试验用的培养基中含有硫代硫酸钠，它是一种还原剂，能保持还原环境，使形成的硫化氢不再被氧化。
【材料】
1．菌种：
大肠杆菌，变形杆菌的琼脂斜面18~24小时培养物。
2．培养基：
醋酸铅培养基。
【方法】
1．分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌于醋酸铅培养基中。
2．37℃孵育24小时后观察结果。
五、常用灭菌器及滤菌器（录像）
（一）高压蒸气灭菌器
1．构造：
高压蒸气灭菌器（图2－8）是一个双层的金属圆筒，两层之间盛水。
外层坚厚，其上或前方有金属厚盖。
盖旁附有螺旋，借以紧闭盖门，使蒸气不能外溢。
因而随着蒸气压力升高，其温度亦相应增高。
它们之间的关系如下表：
不同蒸气压力能达到的温度
蒸气压力
（温度℃）
磅／平方吋
公斤／平方厘米
5
8
10
15
20
25
30
O．35
0．56
O．70
1．05
1．40
1．75
2．10
108．8
113．O
115．6
121．3
126．2
130．4
134．6
高压蒸汽灭菌器上装有排气阀门、安全活塞，以调节器内蒸汽。
有温度计及压力表，以示内部的温度和压力。
器内装有带孔的金属搁板，用以放置欲灭菌物件。
2．加水至器内，放入被灭菌物件。
将器盖上，螺旋转紧使之密闭。
器下用煤气或电等加热，同时开排气阀门，使器内冷气完全逸出，否则压力表上所示压力并非全部是蒸气压力，器内不能达到理想温度，灭菌将不完全，器内温度和冷气排除量的关系见下表。
高压蒸汽灭菌内温度与空气排除量的关系
压力表上所示
能达到的温度（℃）
压力
（磅／平方吋）
空气完
全排除
空气2/3
排除
空气1/2
排除
空气1/3
排除
空气全
未排除
5
10
15
20
25
30
109
115
121
126
130
135
100
109
115
121
126
130
94
105
112
118
124
128
90
100
109
115
121
126
72
90
100
109
115
12l
待空气全部排出，关闭排气阀．继续加热，待压力表渐升至所需磅数（一般是15磅），减少炉火，维持15－20分钟。
若采用蒸汽加热，则可直接将蒸汽通入灭菌器内，至所需温度即可（图12）。
灭菌时间到达后，停止加热或关闭蒸汽，待压力逐渐自行降至零时，徐徐打开排气阀，排除余气、开盖取物。
切不可在压力尚未降低时突然打开排气阀门，放气减压。
因为这样，将使瓶内液体等冲出外溢。
高压蒸汽灭菌为最可靠方法，凡耐高热潮湿的物件，如培养基、生理盐水、衣服、纱布、棉花等敷料、玻璃器材、传染性脏物及细菌培养物等都可应用本法消毒灭菌。
（二）阿诺（Arnold）流动蒸汽灭菌器
1．构造：
阿诺流动蒸汽灭菌器（图2－9）的构造象一般的蒸笼，上端插入温度计。
先加水于双层的金属锅内，锅底下加热。
因双层间水的容量不大，容易煮沸而形成蒸汽，使器内温度上升至100℃。
蒸汽通经中央圆筒直至灭菌器内的被消毒物件。
多余的蒸汽自器的隙缝逸出。
遇及温度低于100℃的外壳时，重新凝结成水，返回于水锅内，这样可以不需经常加水。
另一形式的流动蒸汽灭菌器（图2－10）是以金属板或石棉板制成圆筒形或长方形箱，底层盛水，其上有1~2层带孔金属隔板，借以放置消毒物件。
箱顶或旁侧有进水漏斗和排水龙头。
2．用法：
向锅内加水至略低于搁板下面，再将欲灭菌物件放入器内搁板上。
点火加热以产生蒸汽，使锅内温度达100℃并维持30分钟左右，在普通大气压下，蒸汽温度不会超过100℃，细菌繁殖体一般可被杀死，但不能杀灭芽胞。
所以，使用流动蒸汽灭菌，往往须按灭菌的性质进行间歇灭菌，每日一次，连续三次。
本法用于不耐高温的糖类、马铃薯、牛奶等培养基的灭菌。
（三）干热灭菌器（烤箱）
3．构造：
干热灭菌器（图2－11）是由双层铁板制成的长方形金属箱，外壁内层装有隔热的石棉板，底下放置大型火炉，或在箱壁中装置电热线圈或煤气管道，上有数孔，安插温度计及供空气节流通用。
箱前有铁门及玻璃门，箱内有金属板架数层。
电热烤箱的前下方装有温度调节器，可以保持所需的温度。
4．用法：
将培养皿、吸管、试管等玻璃器材包装后放入箱内，闭门加热。
当温度上升至160~170℃，保持2小时．到达时间后，停止加热，等温度自然下降至40℃以下，方可开门取物。
否则冷气突然进入，易引起玻璃炸裂，且热空气外溢，往往会灼伤取物者的皮肤。
一般吸管、试管、培养皿、凡士林、液体石蜡等用本法灭菌。
（四）滤菌器：
滤菌器由孔径极小（一般孔径在0.10-1微米之间，常用0.22微米孔径的过滤膜即可达到除菌的目的），能阻挡细菌通过的石棉、醋酸纤维膜或玻璃细砂等制成。
种类多，常用的有：
1．塑料滤器：
由塑料制成，中间滤膜为醋酸纤微膜，多为一次使用。
2．不锈钢滤器：
由不锈钢制成，中间可根据需要安装石棉滤板或醋酸纤维滤膜等，同时，在过滤时还可以加压，以加快过滤速度。
（图2-12）
过滤法用以除去糖溶液、血清、腹水、某些药物等不耐热液体中的细菌，也可用来分离病毒、细菌和其毒素等。
六、常用物理消毒法
（一）细菌对湿热的抵抗力（操作）
【材料】
1．菌种：
大肠杆菌，枯草杆菌18~24小时培养物。
2．培养基：
肉汤管。
3．65℃水浴箱、100℃水浴箱。
【方法】
1．取8支肉汤管，其中4支接种枯草杆菌，4支接种大肠杆菌各一接种环。
2．取接种有枯草杆菌和大肠杆菌的肉汤管各1支，置65℃水浴箱内加热5分钟，取
出，立即以自来水冲凉。
3．同2，但改为65℃加热30分钟。
4．同2，但改为100℃加热5分钟。
5．各留下一支作为对照。
6．将所有8支种有细菌经不同处理的肉汤管置37℃孵育，18~24小时后观察
各管生长情况。
（二）紫外线对细菌的作用（操作）
【原理】
医学上通常使用紫外线灯以产生人工紫外线。
波长为200~300nm的紫外线具有杀菌作用，其中以265~266nm最强，这与DNA的吸收光谱范围一致。
其杀菌机理是在DNA中引起胸腺嘧啶双聚体形成，从而干扰了DNA的复制，导致细菌死亡。
【材料】
1．菌种：
大肠杆菌肉汤18~24小时培养物，枯草杆菌肉汤24~48小时培养物。
2．培养基：
琼脂平板。
3．紫外线灯消毒柜。
【方法】
1．用记号笔将琼脂分成二部分，用接种环沾取大肠杆菌或枯草杆菌菌液多
环，分别在琼脂平板培养基一部分的表面上来回涂满。
2．将分别涂满二菌的琼脂平板用皿盖盖住一半后（二菌应都被遮去1／2），
在离紫外线灯的2~3尺处，直接受紫外线照射30分钟。
然后盖好皿盖，37℃孵育24小时后观察生长情况。
七、生物因素对细菌的影响
（一）细菌对抗生素的敏感性测定（药敏试验）（示教）
【材料】
金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌18~24小时肉汤培养液、琼脂平板培养基、抗生素纸片（浸沾一定浓度的青、链、氯、庆大霉素后，37℃烘干备用）、尖头镊子。
【方法】
1．取琼脂平板培养基2块，分别于其底部玻璃上注明金黄色葡萄球菌及痢疾
杆菌，并用蜡笔将平皿底部划分四等分，分别注明青、链、氯、庆大霉素。
2．将二菌菌液分别涂于上述二个培养基平板上。
3．镊子经火焰灭菌，镊取各药物纸片，分别贴于涂有细菌的培养基平板表面
相应位置上。
4．置37℃中孵育18~24小时，观察纸片周围有无抑菌圈，并比较各抑菌圈
的大小，判断二菌对抗生素的敏感度。
附：
纸片法药敏试验纸片含药量和结果解释（NCCLS1998年）
细菌种类
抗生素
纸片
含药量
抑菌环直径
耐药中介敏感
葡萄球菌属
青霉素
10U
≤28-≥29
红霉素
15μg
≤1314～22≥23
庆大霉素
10μg
≤1013～14≥15
万古霉素
30μg
--≥15
环丙沙星
5μg
≤1516～20≥21
克林霉素
2μg
≤1415～20≥21
肠杆菌科
氨苄西林
lOμg
≤1314～16≥17
环丙沙星
5μg
≤1516～20≥21
头孢西丁（
30μg
≤1415～17≥18
丁胺卡那
30μg
≤1415～16≥17
头孢他啶
30μg
≤1415～17≥18
复方阿莫西林
20／10μg
≤1314～17≥18
NCCLS：
美国临床实验室标准化委员会
（二）噬菌体对细菌的作用—特异性裂解试验（平板法）（示教）
【材料】
大肠杆菌及痢疾杆菌琼脂斜面培养物、琼脂平板培养基、痢疾杆菌噬菌体。
【方法】
1．取琼脂平板一只并划分三等，分别标明1、2、3。
2．以接种环将痢疾杆菌分别密涂于1、3两处，2处涂布大肠杆菌。
3．用接种环沾取痢疾杆菌噬菌体加于1、2处的中央，另取l接种环肉汤放
于3处中央。
4．将此培养基平板置37℃孵育12~24小时，观察噬菌斑出现的位置加以分
析。
附录：
一、单糖发酵管培养基制备：
配制各种单糖成20％浓度的水溶液，8磅蒸汽压力下灭菌15分钟。
取pH7．6的蛋白胨水1000毫升，加入1．6％溴甲酚紫液1毫升，混合后分装于内置一支玻璃小倒管的10×100毫米试管，每管约3－4毫升，15磅蒸汽压力下灭菌15分钟。
取出后各管贴上颜色标签或在棉塞上染以颜色。
在细菌学中，通常红色代表葡萄糖、黄色代表乳糖、白色甘露醇、紫色麦牙糖等，最后以无菌操作加入相应的灭菌糖溶液至每管中，使最终浓度为l％。
二、IMViC试验所需培养基，试剂
（一）培养基
1．蛋白胨水：
将蛋白胨10克、氯化钠5克溶解于蒸馏水1000毫升中，调
整酸碱度至pH7.6，15磅蒸汽压下灭菌20分种，若作吲哚试验者，宜采用多胨，因其中含色氨酸较多。
2．葡萄糖蛋白胨水：
溶解蛋白胨5克，葡萄糖5克、磷酸氢二钾5克于蒸
馏水1000毫升中，调整至pH7.2，滤纸过滤，分装后，经8磅蒸汽灭菌15分钟。
3．枸橼酸盐斜面培养基：
溶解磷酸二氢铵0.1克、硫酸镁0.02克、磷酸氢
二钾0.1克、枸橼酸钠0.2克、氯化钠0.5克于蒸馏水100毫升中，加入琼脂2克。
加热溶化之。
酸碱度调整至pH6．8，加入指示剂0.5%溴麝香草酚兰酒精溶液2毫升。
摇匀，脱脂棉过滤，分装，15磅蒸汽压下灭菌20分钟，趁热制成斜面。
制就的枸橼酸盐培养基应呈绿色。
（二）试剂
1．甲基红试剂：
称取甲基红粉剂0.1克,溶于95％酒精300毫升中，再
以蒸馏水稀释至500毫升。
2．对二甲基氨基苯甲醛（吲哚试剂）：
对二甲基氨基苯甲醛5g与戊醇或丁
醇75毫升混合，置50～60℃水浴箱中过夜。
次日取出，徐徐滴入浓盐酸25毫升，滴加时随滴随摇。
配后放暗处备用。
（三）其他生化反应用培养基
1．醋酸铅培养基：
加热融化2％肉汤琼脂200毫升，加入硫代硫酸钠0.5
克。
混合后，15磅蒸汽压下灭菌20分钟。
待冷至45℃，无菌操作加入经间歇灭菌的10％醋酸溶液1毫升。
分装、直立静置待凝。
2．尿素固体培养基：
取蛋白胨0.1克、氯化钠0.5克，磷酸二氢钾0.2
克、琼脂2克于蒸馏水100毫升中，加热溶化。
调正pH至7.4，脱脂棉过滤。
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