固定化酶研究进展.docx

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固定化酶研究进展

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固定化酶的研究进展

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固定化酶的研究进展

摘要：

酶的固定化技术是酶工程领域研究的重点和热点之一。

本文综述了固定化酶制备的传统方法以及一些新方法，固定化酶的性质、制备原则、应用领域，以及制备过程中存在的一些问题，并对其发展前景进行了展望。

关键字：

酶的固定化；制备方法；应用领域；研究进展

ResearchProgressofEnzymeImmobilization

Absteact:

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1．固定化酶的概述

固定化酶“immobilizedenzyme”这个术语是在1973年酶工程会议上被推荐使用的[1]。

Trevan在1980年给出了固定化酶的一个定义：

酶的固定化就是通过某些方法将酶与载体相结合后成为不溶于含有底物的相中，从而使酶被集中或限制在一定的空间范围内进行酶解反应[2]。

其实，固定化酶并不是新的东西，例如：

胞内酶是在细胞内起作用的，类似于我们用包埋方法制成的固定化酶。

因此我们所进行的固定化酶的研究一定程度上可以认为是为了使酶在更接近于其原始状态下进行反应[3]。

人类历史上最早进行酶固定化的研究是在1916年，Nelosn和Griffin发现蔗糖酶吸附在骨炭微粒上仍保持与游离酶同样的活性。

但在此后的将近40年的时间里，由于人们没有认识到固定化酶的应用前景，因而对固定化酶的研究非常少。

直到进入五十年代以后，人们才逐渐认识到固定化酶的应用价值，因此为了更有效地利用酶，才开始积极地对各种酶的固定化技术进行研究与开发。

1953年Grubhofer和Schleiht通过重氮化共价结合法将多种酶固定在聚氨基苯乙烯树脂上[4]；1963年，Bernfeld和Wan利用聚丙烯酰胺包埋法固定了多种酶[5]；1969年，日本的千烟一郎等将固定化酰化氨基水解酶用于DL-氨基酸的拆分，生产L-氨基酸，并成功地实现了工业化[6]。

固定化酶与游离酶相比，具有很多优点[7]：

1）极易与底物、产物分离；2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；4）酶反应过程能够加以严格控制；5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；6）较游离酶更适合于多酶反应；7）可以增加产物的收率，提高产物的质量；8）酶的使用效率提高，成本降低；9）部分脂肪酶经固定化还可以有效提高其催化拆分的立体选择性和活性。

目前，酶固定化技术己在食品工业、精细化学品工业、医药，特别是手性化合物等行业得到广泛应用，在废水处理方面也取得了一定进展。

用酶技术生产化工产品，条件温和，无三废产生，随着人类对环保的日益关注，酶的应用会更受关注，如何充分利用天然高分子载体，对其改性，或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固定酶，必定会成为研究的热点。

2.传统的固定化技术

酶的固定化方法大致可分为物理法和化学法两大类。

物理方法包括物理吸附法（adosorption）、包埋法（entrapment）。

化学法包括共价法（covalentbinding）和交联法（cross-linking）[8]。

2.1吸附法

吸附法是利用离子键、物理吸附等方法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式（Fig1）。

工艺简便及条件温和是其显著特点，其载体选择范围很大，涉及天然或合成的无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体可以再生[9]。

Fig1.Non-covalentimmobilizationofanenzymeonacarrier.

吸附法可分为两种，物理吸附法和离子吸附法。

物理吸附法是通过氢键、疏水键和π-电子亲和力等物理作用力将酶直接吸附在载体上的方法。

离子吸附法是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基团之间的相互作用而达到酶固定化的方法。

用吸附法制备固定化酶，操作比较简单，可以划分为以下四类[10]：

（1）静态法（statiaprocedure）在没有搅拌、没有振摇的情况下，将载体直接加入酶溶液，通过自然吸附、解吸、再吸附等过程制备固定化酶的方法。

效率低，耗时，吸附量小而且不均匀。

（2）电沉积法（electrodepositionprocedure）在酶液中放置两个电极，在电极临近加入载体，通电，则酶移向电极，并且沉积到载体表面的固定化方法。

在沉积过程中，与酶活力、稳定性有关的某些离子如果发生移除、损漏都要及时补充。

（3）动力学批量式固定化法（dynamicprocedure）这是实验室制备常用的方法，和静态法相比，载体和酶溶液混合后要在搅拌下或者在摇床连续振摇下完成固定化。

此法固定化较为均匀。

要注意控制好搅拌或振摇的速率，既要不破坏酶和载体的结构，又要达到充分混合的目的。

（4）反应器装载法（reactorloadingprocess）这是工业上常用的方法，其特点是将固定化和其后的应用连在一起。

这种方法适用于连续流搅拌桶式反应器（CSTR）和填充床反应器（PBR）。

Mojovic等[11]将Candidarugosa脂肪酶吸附在大孔共聚物载体上，在最优条件下最大吸附量为15.4mg/g，酶固定效率为62%。

动力学研究表明，脂肪酶是通过局部化学反应选择固定在载体上。

作者在卵磷脂/异辛烷存在下，用此固定化酶水解椰子油，酶活力为游离酶的70%重复使用15次后，固定化酶活性仍保持其最初活性的56%。

Kamata等[12]在恒温30℃、24h条件下的水溶液中，将胰蛋白酶和α-淀粉酶固定在珠状糖基蛋白上，实验过程无任何化学改性，所获得的固定化酶相对于固定在阴离子交换剂（器）或脱乙酰几丁质上的酶，有较长的生命周期。

吸附法的优点是，操作简便，条件温和，吸附剂可再生反复使用，酶活力回收率很高。

但也有许多不足，如酶量的选择全凭经验，pH值、离子强度、温度、时间的选择对每一种酶和载体都不同，酶和载体之间结合力不强，易导致催化活力的丧失和玷污反应产物等。

因此，其应用受到一定的限制。

为提高适用性能，大多数科研人员常常将此法与其他方法联合使用[13]。

2.2包埋法

包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微囊结构中。

这样可以防止酶蛋白释放，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。

此法较为简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。

Fig2Entrapmentofbiocatalysts.

（1）凝胶包埋法

将酶包埋在交联的不溶性凝胶的空隙中的方法（Fig2）。

操作时，首先将酶和单聚物混合，然后加入引发剂使单聚物发生聚合，从而制成凝胶固定化酶。

交联聚丙烯酰胺凝胶包埋法是首先被采用的包埋技术。

用此法固定的酶有：

胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、β-淀粉酶、后来又有研究者用此法固定了过氧化氢酶[14]、胰凝乳蛋白酶[15]、β-葡萄糖苷酶[16]。

近年来，有研究者使用天然材料如藻酸盐[17]和卡拉胶（K-Carrageenan）[18]进行包埋固定化研究。

卡拉胶是由角叉菜提取的一种多糖。

将酶的水溶液与卡拉胶在40-60℃的生理盐水溶液中混合，冷却后使凝胶形成，将凝胶浸在0.3M的氯化钾溶液中硬化，硬化凝胶制成适当大小的颗粒，即为固定化酶。

如将此固定化酶再用硬化剂如单宁、戊二醛或六甲叉二胺处理便可以得到更加稳定的固定化酶。

此法条件温和，操作简单，可供多种酶固定化之用。

（2）微囊包埋法[19,20]

将酶包埋于半透性聚合体膜内，形成直径为1-100μm的微囊。

这种固定化酶是以物理方法将酶包埋在膜内的，只要底物和产物分子大小能够透过半透膜，底物和产物分子就能够以自由扩散的方式通过膜[21,22]。

用作微囊材料的有乙基纤维素、聚乙烯等[23]。

为了增加酶的稳定性，微囊内可加入一些血红蛋白，使酶处于一个缓冲环境中[24]。

此外，还可加入一些带有双功能基团的试剂，使酶发生交联，这样也会增加酶的稳定性。

常用的双官能团试剂有戊二醛[25]、鞣酸[26]等。

2.3共价法

酶蛋白分子上功能基和固相支持物表面上的反应基团之间形成化学共价键连接，结力牢固（Fig1.9），使用过程中不易发生酶的脱落，稳定性能好。

该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂，反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。

Fig3Covalentimmobilizationofenzymeonthecarrier:

（A）activeaminoacidresidue;（B）bindingfunctionalityofthecarrier;（C）carrier;（D）spacer.

共价法是固定化酶研究中最活跃的方法。

共价法是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法，研究者对此法研究较为广泛和深入。

可与载体以共价键结合的酶的功能团，包括:

（l）氨基：

赖氨酸的ε-氨基和多肽键的N-末端的α-NH2基；

（2）羧基：

门冬氨酸的β-羧基、谷氨酸的α-羧基和末端羧基；（3）酚基：

酪氨酸的酚环；（4）巯基：

半胱氨酸的巯基；（5）羟基：

丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羟基；（6）咪唑基：

组氨酸的咪唑基；（7）吲哚基：

色氨酸的吲哚基。

最常见的为氨基、羧基、酪氨酸和组氨酸的芳环。

此法的优点是，酶与载体的结合较为牢固，酶不易脱落，但因反应条件较为剧烈，酶活力有所下降，且制备过程较繁琐。

目前，常用的共价结合的方法包括：

（1）重氮法将具有氨基的不溶性载体，以稀盐酸和亚硝酸钠处理、成为重氮化物，再与酶分子偶联[27]。

常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺等。

（2）烷化法和芳基化法以卤素为功能团的载体与酶蛋白中氨基或巯基发生烷基化或芳基化反应而成固定化酶。

此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物。

卤乙酰衍生物包括氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维素、碘乙酰纤维素等。

（3）戊二醛处理法戊二醛与含有伯氨基的聚合物反应，可以生成具有醛功能的模板。

酶蛋白可与用戊二醛处理过的聚合物发生不可逆的结合，例如使用氨基乙基纤维素和戊二醛，可使胰蛋白酶等固定化[28]。

所用载体除氨基乙基纤维素外，也可用DEAE-纤维素、琼脂糖的氨基衍生物和部分脱乙酰甲壳素等。

此外还可以先将酶用物理吸附法吸附于多孔物质上，或者用离子吸附法和用聚乙烯亚胺处理的二氧化硅结合后，再用戊二醛处理[29]。

（4）肽鳌合法Spheron是一种由羟乙基异丁酸酯和乙烯二异丁烯酯共聚而成的大孔亲水凝胶，带有很多羟基，可用肽鳌合法供酶的固定化。

肽盐无毒、无致癌性、价格低廉且载体可以回收。

（5）肽键法此法是将有功能基团的载体与酶蛋白中赖氨酸的ε-氨基或N末端的a-氨基作用形成肽键、成为固定化酶。

例如，用酰基叠氮衍生物固定化。

将纤维素转变为甲酯，再与肼作用，成为酰肼，此酰肼与亚硝酸作用成为相应的叠氮衍生物。

此衍生物在低温下与酶蛋白作用，使酶固定化[28]。

聚甲基谷氨酸通过叠