分散液液微萃取气相色谱质谱法同时测定中毒样品中有毒生物碱和鼠药.docx

分散液液微萃取气相色谱质谱法同时测定中毒样品中有毒生物碱和鼠药.docx

《分散液液微萃取气相色谱质谱法同时测定中毒样品中有毒生物碱和鼠药.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分散液液微萃取气相色谱质谱法同时测定中毒样品中有毒生物碱和鼠药.docx（5页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

分散液液微萃取气相色谱质谱法同时测定中毒样品中有毒生物碱和鼠药

分散液―液微萃取―气相色谱―质谱法同时测定中毒样品中有毒生物碱和鼠药

　　摘要建立了分散液-液微萃取（Dispersiveliquid-liquidmicro-extraction，DLLME）与气相色谱-质谱（GC-MS）联用同时测定中毒样品中3种鼠药（毒鼠强、溴鼠灵、溴敌隆）和5种有毒生物碱（莨菪碱、东莨菪碱碱、钩吻碱、士的宁、马钱子碱）的方法。

100μL萃取剂氯仿与600μL分散剂甲醇混合后，迅速注入样品，萃取过程在乳化体系中完成；以8000r/min离心5min，使两相分层，取下层有机相进行GC-MS分析。

考察了萃取剂、分散剂的种类和体积、萃取时间、pH值及盐浓度对萃取效率的影响。

在优化条件下，各目标物在水样、尿样、黄酒样的检出限为0.003～1.0μg/L，在米饭样品检出限为0.002～0.2μg/kg；各目标物低、中、高加标回收率为81.0%～110%，精密度均小于7%。

本方法灵敏度高，快捷高效，适用于中毒样品中有毒生物碱和鼠药的同时测定。

　　关键词分散液-液微萃取；生物碱；鼠药；气相色谱-质谱；同时测定

　　1引言

　　生物碱和鼠药均可引起急性中毒，危及人体安全。

我国民间常使用中草药浸泡药酒，甚至以此“进补”，容易因误食、过量使用而引发急性中毒；不法分子利用含有毒生物碱的中草药用于谋杀而引起的中毒事故屡有发生。

另外，由于鼠药导致的食物中毒事件频繁发生。

部分鼠药和生物碱中毒的临床症状相似，如毒鼠强与东莨菪碱中毒初期症状均有视力模糊、心跳紊乱等症状。

当疑似有毒生物碱或鼠药中毒事件发生时，医生仅根据患者的临床表现进行诊断，可能存在误诊的风险。

实验室检验能在短时间内检测出致毒物质，让中毒患者得到及时的对症抢救，还可为公安机关侦破案件提供技术支持。

因此，建立快速、准确的生物碱和鼠药同时筛查的方法具有较好的实用意义。

　　目前，对有毒生物碱和鼠药的研究多针对单一生物碱或鼠药。

有毒生物碱和鼠药的常用分析方法包括薄层色谱法（TLC）、液相色谱法（LC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS/LC-MS/MS）、毛细管电泳-电喷雾飞行时间质谱（CE-ESI-TOF-MS）等。

TLC和LC无法对目标物进行结构定性，而LC-MS/LC-MS/MS和CE-ESI-TOF-MS价格昂贵，较难在一般实验室普及。

GC-MS具有价格适中、分析速度快、可对目标化合物进行准确定性的优点，在一般实验室中普及率较高。

尚未见对上述5种生物碱和3种鼠药采用GC-MS同时检测的报道。

另外，中毒样品的前处理多采用液-液萃取、固相萃取等方法，这些前处理方法需求样品量较大、操作繁琐，耗时，消耗试剂较多，不能很好地适应中毒应急检测的需要。

分散液-液微萃取技术（DLLME）是由Rezaee等于2006年提出的一种环保、高效、简便、成本低、富集倍数高的样品富集技术。

目前，DLLME已被广泛应用于不同基质样品痕量分析。

本研究对DLLME过程中的各种影响条件进行优化，采用GC-MS检测方法，成功将其应用于水、尿液、黄酒及米饭等模拟毒样品中鼠药和生物碱的同时测定。

　　2实验部分

　　2.1仪器与试剂

　　TraceGCUltra-ISQ气相色谱-质谱联用仪（美国ThermoFisher公司）；HS20500D离心机（中国恒奥公司）；漩涡振荡器（美国SI公司）；MilliQBiocelA10超纯水系统（法国Millipore公司）；生物碱及鼠药标准：

莨菪碱、东莨菪碱（98.87%，TRC公司）；马钱子碱（98.87%）、士的宁（99.5%），ChemService公司）；钩吻素甲（98.87%）、毒鼠强（99.5%）、溴鼠灵（98.87%）、溴敌隆（99.5%）均由北京世纪奥科生物技术有限公司提供；甲醇、乙腈、丙酮、四氢呋喃、氯仿、四氯化碳、氯苯、二硫化碳（分析纯，广州化学试剂厂）；混合标准储备液中各目标物浓度见表1。

　　空白水样为自来水；空白尿样由志愿者提供；空白酒样为客家黄老酒（广东省河源市紫金县紫金实业发展有限公司）；空白饭样为熟米饭。

　　2.2疑似中毒模拟样品制备与处理

　　2.2.1样品制备分别取空白水样、尿样、酒样1mL，米饭样1g于15mL离心管中，加入适量目标物混合标准溶液，振荡摇匀，得到模拟中毒样品。

　　2.2.2样品处理经2.2.1节处理后的样品，加入10mL5%（w/V）NaCl溶液，经NaOH溶液调节至pH8。

米饭样品先经离心，取上层清液5mL再进行后续步骤。

将100μL氯仿和600μL甲醇的混合液快速注入样品中，获得浑浊、雾化乳浊液。

10s后8000r/min离心5min，取下层有机相进行测定。

　　2.3色谱与质谱条件

　　色谱条件：

色谱柱：

DB-5MSUI毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm），进样口温度：

280℃；柱温升温程序：

初始温度80℃，保持1min，以20℃/min升温到280℃，保持23min，再以40℃/min升温到300℃，保留1min；质谱条件：

离子源温度：

280℃；传输线温度：

280℃；EI电压：

70eV；选择离子模式测定，各种待测物选择离子见表1。

　　3结果与讨论

　　3.1样品前处理条件的优化

　　3.1.1萃取剂种类与体积的选择传统的分散液-液微萃取常采用密度高于水且在水中溶解度小、对目标成分具有良好萃取能力、色谱出峰不影响目标物的有机溶剂作为萃取剂。

本实验分别考察了氯苯、二硫化碳、氯仿和四氯化碳4种有机溶剂作为萃取剂时目标物的回收率。

图1A表明，氯仿对8种目标物均具有较好的萃取效率。

因此，选氯仿作为萃取剂。

考察氯仿体积在40～120μL时各目标物的回收率，如图1B所示，大多数目标物在100μL时达到最佳萃取效果，因此，选择氯仿的优化体积为100μL。

　　3.1.2分散剂种类与体积的选择分散液-液微萃取要求分散剂与萃取剂和水均可混溶，两者混合加入，使萃取剂以微小液滴高度分散于水相中，增大两相接触的比表面积，有效缩短萃取时间，同时提高萃取效率。

本实验分别考察了丙酮、乙腈、甲醇、四氢呋喃作为分散剂时目标物的回收率。

结果表明，甲醇对大多数目标物有较好萃取效率，选取甲醇作为分散剂并考察其在400～1500μL范围内对回收率的影响，发现甲醇的体积为600μL时目标物回收率较高。

因此，选择甲醇的优化体积为600μL。

　　3.1.3pH值及盐浓度的影响考察了pH2～14范围内目标物的回收率。

结果表明，大多数目标物在pH=8时有较高回收率。

一般情况下，水相离子强度增加会降低目标物在水中的溶解度，从而提高萃取效率。

实验考察了NaCl浓度在0～15%（w/V）范围内对目标物回收率的影响，结果表明不同浓度NaCl对生物碱的萃取效率影响较大，对鼠药的萃取效率影响不明显。

这可能是由于鼠药在氯仿中溶解度较大，在萃取过程中鼠药受水相盐浓度的影响较小。

因此，选择pH=8，NaCl浓度为5%（w/V）的条件对目标物进行萃取。

　　3.2方法学考察

　　3.2.1方法的线性关系与检出限、定量限取空白液态样品1mL，米饭样品1g，将储备液（浓度见表1）用甲醇稀释1，2，5，10，20倍后加入样品中，每一浓度5份，再按2.2节对样品进行提取，在优化的色谱-质谱条件下，对目标物进行分析。

考察了方法的线性范围、检出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10），结果见表2。

表明本方法灵敏度远低于各目标物的中毒剂量，可用于疑似鼠药或生物碱中毒症状的快速筛查。

　　3.2.2方法的回收率与精密度取空白样品，准确加入适量的混合标准溶液，按照2.2节进行提取，在相同的色谱-质谱条件下平行测定3次，计算回收率和精密度（表3）。

结果表明，目标化合物在不同基质中加标回收率为81.0%～110%。

图2为标准溶液、尿液、黄酒、米饭加标后的典型色谱图。

　　研究结果表明，本方法可快速测定食物中毒样品中3种鼠药（毒鼠强、溴鼠灵、溴敌隆）和5种有毒生物碱（莨菪碱、东莨菪碱碱、钩吻碱、士的宁、马钱子碱）。

与传统萃取方法相比，DLLME具有所需样品量少，萃取时间短，操作简单、快速的特点，适用于中毒事件和法医毒物分析中鼠药和生物碱中毒的快速分析。

　　References

　　1CAIXue-Ying，MENGBo，YANGBing.BeijingJ.Tradit.Chin.Med.，2006，25（3）：

171-172

　　蔡雪映，孟礴，杨冰.北京中医，2006，25（3）：

171-172

　　2LiJ，JiangY.Biomed.Chromatogr.，2010，24

（2）：

186

　　3YuZH，WuZP，GongFJ，WongR，LiangC，ZhangYR，YuYQ.J.Sep.Sci.，2012，35（20）：

2773-2780

　　4FourelI，HugnetC，Goy-ThollotI，BernyP.J.Anal.Toxicol.，2010，34

（2）：

95-102

　　5ZHANGChun-Hua，WUHui-Qin，HUANGXiao-Lan，ZHUZhi-Xin，HUANGFang，LINXiao-Shan，LUOHui-Tai.ChineseJ.Anal.Chem.，2012，40（6）：

862-869

　　张春华，吴惠勤，黄晓兰，朱志鑫，黄芳，林晓珊，罗辉泰.分析化学，2012，40（6）：

862-869

　　6WUHui-Qin，ZHANGChun-Hua，HUANGXiao-Lan，ZHUZhi-Xin，HUANGFang，LINXiao-Shan，LUOHui-Tai.JournalofInstrumentalAnalysis，2013，32（9）：

1031-1037

　　吴惠勤，张春华，黄晓兰，朱志鑫，黄芳，林晓珊，罗辉泰.分析测试学报，2013，32（9）：

1031-1037

　　7YANHui，SHENMin.FudanUniv.J.Med.Sci.，2011，38（4）：

361-366

　　严慧，沈敏.复旦大学报（医学版），2011，38（4）：

361-366

　　8DhalwalK，ShindeVM，NamdeoAG，MahadlikKR，KadamSS.J.Chromatogr.Sci.，2007，45：

706-709

　　9WANGXueHu，YUANMin，ZHANGQian-Shang，ZHAOWu-Sheng，GUYue-Bao.PhysicalTestingandChemicalAnalysis（PartB：

ChemicalAnalysis），2011，47（4）：

427-432

　　王学虎，袁敏，张前上，赵武生，顾月保.理化检验（化学分册），2011，47（4）：

427-432

　　10ZHANGRui，LEINing-Sheng，LINYing，SHUXiao-Chuan.GuangxiJ.Med.，2012，19（3）：

239-243　　张瑞，雷宁生，林莹，苏小川.广西医学，2012，19（3