微生物脂肪酶的应用.docx

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微生物脂肪酶的应用

　微生物脂肪酶及其相关研究进展

摘要：

微生物脂肪酶是一种重要的工业酶类，也是当前国内外研究的热点。

就微生物脂肪酶在食品加工、手性化合物合成、脂肪水解、脂肪酸提纯、三甘酯结构测定和环境治理等方面的应用及研究近况进行综述。

关键词：

微生物脂肪酶；催化；手性；应用

微生物脂肪酶具有种类多、比动物脂肪酶具有更广的作用pH和作用温度范围、便于进行工业生产和获取高纯度制剂等优点而得到广泛应用，特别是在油脂化工和有机合成工业中，酶催化的反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点。

尤其是1,3专一脂肪酶，可用于特殊脂肪酸、单甘酯的合成及立体选择性化学合成和拆分，具有巨大应用潜力。

经近20年来的深入研究，能应用于工业生产的微生物脂肪酶种类不断增加，目前已遍及细菌、酵母及霉菌各大类中，最近公布的36种不同来源的商业化脂肪酶中有19种来源于真菌，8种来源于细菌。

同时，随着生物技术的日新月异，酶固定化技术、界面酶学和非水解酶学研究的突破性进展，使得人们对微生物脂肪酶产生了极大的兴趣。

当前脂肪酶在国内外均有生产，微生物脂肪酶的多功能性不仅对传统的工业领域具有重要的影响，而且在许多新的工业领域也得到了广泛的应用[1-4]。

1脂肪酶的来源及结构

1.1　脂肪酶的来源

脂肪酶的来源非常广泛,在许多动植物及微生物中存在[5]。

植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子,动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织等,微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源,它包括细菌、酵母和霉菌产生的脂肪酶。

1.2　脂肪酶的分子结构

脂肪酶是一种糖蛋白。

其糖基部分约占分子量的2%～15%,以甘露糖为主,整个分子由亲水部分和疏水部分组成,活性中心靠近分子的疏水端。

Brockerhoff提出了脂肪酶在油—水界面定向的假设在研究了10种脂肪酶的三维结构并比较了21种脂肪酶的区域选择性后如下结论。

1）脂肪酶都包括同源区段:

His—X—Y—G1y-Z—Ser—W—G1y—或Y—G1y—His—Ser—W—G1y（X,Y,W,Z是可变的氨基酸残基）。

2）活性中心是丝氨酸残基,在正常情况下该残基受一个α—螺旋盖的保护,当脂肪酶与界面相接触时,此盖打开,通过亲电子域的创造导致脂肪酶的构象改变,此亲电子域在丝氨酸残基周围,由疏水残的暴露和亲水残基的包埋来完成。

从而增加了脂类底物复合物的亲和性,并稳定了催化过程中的过渡态中间产物[6～8],而酶分子的周围通常存留一定量的水分,从而保证在油—水界面和有机相中的自体激活[10]。

脂肪酶在油—水界面上被激活的比率很高,可达10倍以上（水解活力）。

Winkler研究了猪胰脂肪酶和人胰脂肪酶的一级结构[11],发现其一级结构极其相似,从而显示了它们催化特性上的一致性和相似性。

有些脂肪酶的界面吸附作用主要取决于界面的理化特性。

而这些理化特性受磷脂或胆酸盐等的极大影响。

当这类两亲物质存在时,甘油三酯一水界面的疏水/亲水平衡被打破,辅因子结合于脂肪酶特定位点并通过其疏水端吸附于界面,使活性中心周围的“flaplid”打开,显示出界面激活作用。

1.3　微生物脂肪酶的产生菌及筛选方法

Fagery规定优良产酶菌株的标准应是短时、营养基质低廉、菌株易分离、胞外酶、非致病菌、不产生毒素、遗传性状稳定及对噬菌体不敏感等。

目前,产脂肪酶菌株主要集中在根霉、曲霉、假丝酵母、青霉、毛霉、须霉及假单胞菌等。

脂肪酶的筛选方法着眼于快速、简捷、准确、选择性强及易于自动化上。

谢舜珍采用油脂同化平板,以油为唯一碳源进行同化试验并测定摇瓶发酵培养后的发酵液酶活力。

沈永祥等[12]筛选到一株脂肪酶菌—阿氏假囊酵母。

施巧琴[13]利用脂肪酶作用脂肪后产生脂肪酸与维多利亚蓝反应呈蓝绿色的透明圈平板法经摇瓶发酵复筛得到产碱性脂肪酶的扩展青霉。

Rollof,J等[14]从患频发性疖病人身上分离到产脂肪酶的金黄色葡萄球菌。

近年来随着细胞工程、基因工程、固定化技术的兴起,脂肪酶的研究特别是对产脂肪酶的菌株诱变育种及基因克隆等方面取得长足进展。

1979年,我国研究开发了解脂假丝酵母AS211405。

它是紫外线及亚硝基胍处理选育出的脂肪酶高产变株,施巧琴[15]对产碱脂肪酶596用亚硝基胍,紫外线,盐酸羟胺,秋水仙碱等诱变因子进行作用得酶活力为原始菌16.6倍的突变株Un—503,每毫升发酵液活力达400U以上。

Ibrahim,C.0对由绵毛状腐质霉产生的脂肪酶用AmberlilexAD—7和戊二醛交联法制得一种固定化酶。

Motoyasu,O等报道了脱氮产碱杆菌TK7和绿脓假单胞菌OLI脂肪酶生产基因用RP4:

Mu质粒转移到大肠杆菌JA2211上,重组克隆分子拥有原菌体的80%～115%的脂肪酶活力。

2脂肪酶的应用

2.1食品加工方面的应用

脂肪酶现已用于奶制品，如奶酪、奶油和人造黄油的增香。

因为奶制品中的香味是牛奶中的脂肪、蛋白质和乳糖代谢的产物，因此，脂肪酶和蛋白酶被广泛地用于加快奶酪的熟化和香味的产生。

用脂肪酶处理过的奶制品比未处理的具有更好的香味和可接受性。

除奶制品外，脂肪酶也用于改善稻米和酒精饮料的香味，如在酒精饮料的发酵过程中加入一定量的脂肪酶，产品具有类似奶酪的香味。

脂肪酶还用于无脂肪肉的生产，如在鱼加工过程中脂肪的去除是用脂肪酶来完成的。

另外，在生面团中加入脂肪酶使三甘酯部分水解而增加单甘酯的含量可延缓腐败，单甘酯和双甘酯的形成也使蛋白的起泡性质得到改善。

2．2手性化合物合成中的应用

脂肪酶催化具有高底物专一性、区域选择性或对映选择性等优点，使其成为有机合成中重要的生物催化剂。

脂肪酶催化合成手性化合物的基本类型有两个：

（1）前手性底物的反应；

（2）外消旋化合物的拆分。

催化的底物已由传统的前手性或手性醇和羧酸酯扩展到二醇、二酯、内酯、胺、二胺、胺基醇、α或β羟基酸，因此，大多数重要的功能有机化合物原则上都可被脂肪酶催化立体选择性地制备。

典型的生物催化剂包括细菌脂肪酶，如P.aeruginosa、P.fluorescens、Pseudomonas、B.cepacia、C.viscosum、Bacillussubtilis、Achromobactersp.、Alcaligenes和Serratiamarcescens以及来自真菌的C.antarcticaB和C.rugosa。

然而，尽管在这方面有大量的报道，脂肪酶的工业对映选择性过程却受到限制。

一般存在以下问题：

（1）不充分的对映选择性；

（2）有限的酶活性；（3）脂肪酶回收困难；（4）固有的最大的动力学拆分效率只能达到50%。

不过这些问题正在被解决，除了优化反应条件如溶剂、温度、酰化基团外，当前最重要的研究包括：

（1）脂肪酶分子的体外改造，作为增加对某一选定底物的对映选择性的一种方法；

（2）新的固定化技术使酶在有机介质中的活性和稳定性提高；（3）循环技术使脂肪酶多次重复使用成为可能；（4）生物催化剂的动力学拆分与化学反应的巧妙结合可使产率提高到80%以上。

在不久的将来，利用脂肪酶工业化合成手性化合物是完全可能的[18]。

2.3脂肪水解方面的应用

水解反应是指脂肪酶催化脂肪或酯，将其水解为脂肪酸和甘油或醇。

脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的水解反应，利用脂肪酶水解油脂的能力可获得重要的轻化工原料脂肪酸和甘油。

用于这种目的脂肪酶包括来自Candidarugosa，Pseudomonashuorescen和蓖麻种子（castorbean）等的脂肪酶[19]。

水解的底物包括各种植物油，如大豆油、蓖麻油、橄榄油等；动物油如牛脂、羊脂和鱼油及各种油的酯类。

酶催化反应通常在环境温度、压力下进行，反应条件温和，能耗低，且不需高温、高压、强防腐设备，产品具有良好的颜色和气味。

由于没有或很少有副反应，产品往往具有较高的纯度，使下游工艺简化。

通过脂肪酶催化可从含有多不饱和脂肪酸（PUFA）的不稳定油脂中获得脂肪酸，而用传统的高温、高压的化学法生产这类脂肪酸则很困难，因为高温将导致不饱和脂肪酸的氧化。

还有如用蓖麻油（castoroil）水解生产蓖麻酸，由于脱水、内酯化等副反应，不能用传统的蒸气裂解方法生产，但用来自蓖麻种子的脂肪酶水解蓖麻油，则可避免这些弊端，该工艺已实现商业化生产[20]。

2．4在生物柴油合成中的应用

生物柴油作为一种替代能源在能源战略上具有极其重要的作用，而且是目前能源发展的一个重要方向，可作为可再生能源和清洁能源的典范。

李俊奎等［21］以提取的毛油和甲醇为原料，用固定化的假丝酵母（Candidasp.）99-125脂肪酶进行脂肪酸甲酯（FAMEs）的合成试验，结果表明，用固定化的脂肪酶催化石油醚得到的大豆和小桐子毛油制备FAMEs，其产率均保持在70%以上，具有良好的工业化前景。

刘伟东等［22］采用Candidasp.99-125菌株研究了其在丁二酸二酯磺酸钠（AOT）反胶束体系中催化大豆色拉油合成生物柴油的新方法。

考察了溶剂极性、AOT浓度、W0（水与表面活性剂质量比）、缓冲溶液pH值、温度等因素对生物柴油合成的影响，结果表明，在优化条件下单批最高酯转化率可达到90%。

刘志强等［23］研究了脂肪酶催化菜籽油醇解反应的几个因素，并获得了最佳条件，在该条件下，一次加乙醇时转酯率可达86%，采用3步加醇，转酯率高达93%。

李元元等［24］利用固定化脂肪酶催化棉籽油合成生物柴油工艺，结果表明，固定化酶后，酶稳定性有所改善，同时还研究了最佳转酯化条件，在最佳条件下，转化率可达65%。

周丽亚等［25］以预处理的废餐饮油和乙酸甲酯为原料，在Novozym435的催化下研究了制备生物柴油的工艺条件，在最佳条件下，生物柴油得率为86.43%，产物符合美国生物柴油质量标准和我国－50#轻柴油的标准，具有较好的柴油机燃烧性能。

3前景与展望

近年来随着细胞工程、基因工程、固定化技术的兴起，脂肪酶的研究特别是对产脂肪酶的菌株诱变育种及基因克隆等方面也取得长足进展。

目前，脂肪酶主要用于高价值的产品和具有热敏性的底物或产品，随着人们生活水平的提高，在食品、牛奶、香水、化妆品和医药中添加天然成分的产品越来越受消费者青睐。

由天然底物生物合成的化合物被认定为天然产物，而同样的原料用化学法生产的产物则不受欢迎。

因此，天然成分在今后将会具有很大的需求，这使生物催化剂极具吸引力，所以说，脂肪酶在油脂、食品、医药、化妆品等领域具有光明的应用前景。

参考文献：

[1]谈重芳，王雁萍，陈林海,等.微生物脂肪酶在工业中的应用及研究进展[J].食品工业科技，2006,27（7）:

193-195

［2］JAEGERKE，REETZMT.Microbiallipasesformversatiletoolsforbiotechnology［J］.TrendsinBiotechnology，1998，16（9）:

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［3］JAEGERKE，EGGERTT.Lipasesforbiotechnology［J］.CurrentOpinioninBiotechnology，2002，13（4）:

390－397.

［4］DICKEYD，ATLANTAG.ImprovingthecatalyticactivityofCandidaantarcticalipaseBbycircularpermutation［J］.JAmChemSoc，2005，127（39）:

13466－13467.

［5］谈重芳，王雁萍，陈林海，等.微生物脂肪酶在工业中的应用及研究进展［J］.食品工业科技，2006，27（7）:

193－195.

［6］刘海洲，吴小飞，牛佰慧，等.脂