蔬菜中有机磷农药残留检测样品前处理方法研究.docx

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蔬菜中有机磷农药残留检测样品前处理方法研究

蔬菜中有机磷农药残留检测样品前处理方法研究

摘要

本论文主要分为四部分：

第一部分:

蔬菜中农药残留检测样品前处理方法研究进展。

介绍了农药的分类、农药残留现状、农药残留检测方法及农药残留检测前处理方法，并对传统的经典前处理放与QuEChERS法比较，分析了传统前处理方法的优缺点。

第二部分:

标准法测定蔬菜中毒死蜱残留的萃取效率。

通过标准法对有机磷农药毒死蜱在各类蔬菜中的萃取效率实验，进一步了解传统的前处理方法，评价国标法在实际检测中的应用，测定了多种蔬菜中农药残留的萃取效率。

1.气相色谱、气质联用色谱比较。

通过对毒死蜱标准曲线的测定，比较仪器的检出限、精密度，对气相色谱的特征检测器，气质联用色谱的质谱检测器做出评价。

气相色谱最小检测限0.1mg/kg，明显低于质谱最小检测限1mg/kg；气相色谱RSD=8.5%，质谱RSD=6.6%。

2.国标法测定油菜、菠菜、芹菜、黄瓜中毒死蜱的萃取效率，并对回收率进行比较，总体回收率57%-78%，RSD=6.1%-8.4%。

第三部分，纤维素蛋白质对毒死蜱回收率的影响。

通过加入纤维素，蛋白质后，对毒死蜱在有机溶剂-水相体系中萃取率的测定，来研究纤维素，蛋白质对毒死蜱的加标回收率的影响。

并测定不同蔬菜中水分，蛋白质的含量，试图通过对不同蔬菜蛋白质含量的比较，找出蔬菜基质中影响毒死蜱萃取效率的原因。

1.毒死蜱在有机溶剂-水相体系中萃取效率的测定。

通过改变实验条件，加入大豆纤维素或蛋白质，来研究纤维素，蛋白质对毒死蜱萃取率的影响。

2.蔬菜中水分、蛋白质含量的测定。

测定油菜、菠菜、黄瓜、茄子、芹菜中的水分、蛋白质含量，比较不同蔬菜中的水分、蛋白质含量。

实验表明菠菜中水分含量90.62%，其他蔬菜水分含量均在94%左右，菠菜中蛋白质含量2.1%，其他蔬菜蛋白质含量在1.2%-1.5%之间。

3.寻找毒死蜱萃取效率与蔬菜中蛋白质含量的关系，确定蛋白质对

蔬菜中毒死蜱的分配平衡有影响，但不是蔬菜中毒死蜱萃取效率的决定因素。

第四部分，蔬菜中农药残留检测前处理方法改进。

传统的前处理方法与QuEChERS法比较，有很多不足之处，不适应当代农药残留的快速检测，本实验以毒死蜱，敌敌畏为例，对标准法进行改进。

1.芹菜中毒死蜱残留检测前处理方法的研究。

通过对溶剂的改进，实验步骤的简化，提高毒死蜱的加标回收率以及检测效率，经改进后，毒死蜱回收率>90%，RSD<10%，检出限<0.005mg/kg。

2.芹菜中敌敌畏的前处理方法研究。

以石油醚为萃取剂，不能够对敌敌畏进行有效的萃取，毒死蜱回收率<70%，因此，选取QuEChERS法，对芹菜中毒死蜱的加标回收率进行测定，并与改进方法比较。

采用QuEChERS法测定，毒死蜱回收率>85%，RSD<10%，符合检测要求。

关键词：

蔬菜；有机磷农药；前处理方法

Abstract

Thispapercanbedevidedintofoursections.

Sectionone:

Theresearchprogresspretreatmentmethodstodetectpesticideresiduesinvegetablessamples.Thissectionbrieflyintroducedtheclassificationofpesticides,thepresentsituationofpesticideresidues,thedetectionmethodofpesticideresidues,andpre-treatmentmethodsofpesticideresidues.Andtraditionalclassicalpre-treatmentwascomparedwithQuEChERSmethodtoanalyzetheadvantagesanddisadvantagesofthetraditionalpre-treatmentmethods.

Sectiontwo:

Therecoveriesofchlorpyrifosinvegetablesweredeterminedbynationalstandardmethod.ByusingGBmethodfororganophosphoruspesticidestodeterminetherecoveriesofchlorpyrifosinvegetables,learnmoreaboutthetraditionalpre-treatmentmethods.

1.GCandGC-MSdeterminationwereCompared.Bymeasuringchlorpyrifosstandardcurve,comparingtheinstrumentdetectionlimit,precision,makeevaluationsbetweenGC-MSdetectorandcharacteristicdetectorofgaschromatography.

2.Wemeasuredchlorpyrifosrecoveriesinrape,spinach,celery,cucumberbyusingnationalstandardmethod,andcomparedtherecoveries.

Sectionthree:

Theeffectsofcelluloseandproteinonchlorpyrifosrecoveryweredetermined.Bydeterminingchlorpyrifosextractionrateafteraddingcellulose,proteininorganicsolvents-aqueousphase,theeffectsofcellulose,proteinonchlorpyrifosrecoverieswerestudied.Andbythedeterminationofthedifferentvegetablesinwater,proteincontent,wetriedtocomparetheproteincontentofdifferentvegetablematrixandtoidentifythefactorsofchlorpyrifosrecoveries.

1.Extractionratesofchlorpyrifosinorganicsolvents-aqueousphaseweredetermined.Bychangingtheexperimentalconditions,addingsoyproteinandcellulose,westudiedtheeffectsofproteinandcelluloseonthe

extractionrateofchlorpyrifos.

2.Moistureandproteincontentinvegetablesweredetermined.Wedeterminedmoisture,proteincontentofrape,spinach,cucumber,eggplant,celery,andcomparedthedifferencesbetweenthevegetables.

3.Lookingforrelationshipsbetweenchlorpyrifosrecoveriesandvegetableproteincontent,wetriedtofindifvegetableproteincanaffectchlorpyrifosrecovery.

Sectionfour:

Pretreatmentmethodsofpesticideresiduesinvegetablesweretriedtoimprove.Thetraditionalmethodofpre-treatment,comparedwithQuEChERSmethod,hasmanyshortcomings,anddon’tsuitforrapiddetectionofpesticideresiduescontemporary,sointhisexperimentweusedchlorpyrifos,dichlorvosasexample,toimprovethenationalstandardmethod.

1.Pretreatmentmethodsforchlorpyrifosincelerywerestudied.Weimprovedpretreatmentmethodsbyusingdifferentsolvent,simplifyingtheexperimentalprocedure,improvingchlorpyrifosrecoveries,anddetectionefficiency.Eventually,theaveragerecoveriesofchlorpyrifoswere>90%,RSDwas<10%,andthedetectionlimitwas<0.005mg/kg.

2.Pretreatmentmethodsfordichlorvosincelerywerestudied.Petroleumetherasextractionsolvent,cannotbeeffectiveextractionofdichlorvos,therefore,weselectedtheQuEChERSmethod,todeterminedichlorvosrecoveries.Eventually,theaveragerecoveriesofchlorpyrifoswere>85%,RSDwas<10%,andtheQuEChERSmethodcanmeetthetestingrequirements.

Keywords:

Vegetables;organophosphoruspesticides;pretreatmentmethods

第一部分蔬菜中有机磷农药残留检测样品前处理方法研究进展

1.1农药的分类及常见农药

按照农药原料来源，农药可分为无机农药：

这类农药不含“碳”元素，如砒霜（As2O3），硫酸铜（CuSO4）等[1]；植物性农药：

这类农药主要利用植物体内的有效成分进行杀菌，杀虫，杀鼠的作用，如鱼藤，烟草等[2]；生物农药：

这类农药主要是通过生物发酵获得有效的孢子，病毒，抗生素等，如苏云金杆菌，井冈霉菌等[3]；有机合成农药：

这类农药通过复杂的的有机合成工艺合成，是目前使用最多的农药[1]。

1.1.1有机汞农药（OrganomercuryPesticide）

有机汞农药多为杀菌剂，属于剧毒农药，不易分解，常见的有机汞杀菌剂有西力生（氯化乙基汞）、赛力散（醋酸苯汞）、富民隆（磺胺汞）和谷仁乐生（磷酸乙基汞）[4]。

有机汞农药中毒表现为汞中毒，侵害肝脏和神经系统。

在食品中，90%以上的汞是以甲基汞存在的，我国已于1971年规定有机汞农药不生产、不进口、不使用[5]。

1.1.2有机氯农药（OrganochlorinePesticide；OPCs）

有机氯农药主要分为两类，一类为氯代苯及其衍生物，如六六六，DDT；另一类为氯化钾撑萘（茚）类化合物，如氯丹，七氯，艾氏剂，狄氏剂等[5]。

有机氯类农药化学性质稳定，不易分解，不易溶于水，易溶于脂肪等有机溶剂。

由于其强脂溶性，有机氯农药会通过食物链，在生物体内慢慢富集，而有机氯类农药的慢性中毒表现主要为影响神经系统，内分泌系统，侵害肝脏肾脏等器官，给生物体带来生理和代谢紊乱[6]。

有机氯农药在二十世纪七十年代初开始被陆续被禁用，但现在在生物体内仍能检出，且生物体内浓度远大于环境浓度。

1.1.3有机磷农药（OrganophosphatePesticide；OPPs）

有机磷农药是继有机氯农药后普遍使用的一类农药，主要为磷酸酯类和硫代磷酸酯类化合物[8]。

有机磷农药对光热较稳定，遇碱易分解，一般不溶于水，易溶于动植物油等有机溶剂，环境残留时间一般较短[9]。

有机磷农药中毒表现主要为抑制胆碱酯酶的活性，使乙酰胆碱生物体神经组织中积累起来，引起神经系统紊乱，严重的会带来神经麻痹,甚至死亡[10]。

另有研究表明，有机磷农药具有遗传毒性，阻碍神经系统的发育，并与癌症的发生关系密切[8,9]。

在我国，除了5种高毒的有机磷农药（甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷和磷胺）被禁用，其他有机磷农药仍在普遍使用[11]。

1.1.4氨基甲酸酯类农药（CarbamatePesticides）

氨基甲酸酯类是以甲酸酯为前体的一类农药,是继有机氯，有机磷农药之后，发展起来的低毒，高效，广谱型农药[12]。

为最主要的有机氮类农药，有西维因、杀灭威、速灭威、叶蝉散，敌草隆、敌稗等[13]。

毒性与有机磷类似,对胆碱活性有抑制作用,但能使胆碱酶快速恢复活性,因此中毒症状消失快,无迟发性神经毒性[14]。

1.1.5拟除虫菊酯类农药（Pyrethroids）

拟除虫菊酯类农药是继有机磷，氨基甲酸酯类农药后的新兴农药，是一种高效，低毒的杀虫剂，对温血类生物毒性较小，很容易代谢降解，目前在全球范围内广泛使用[15]。

拟除虫菊酯类农药的使用同时也带来环境问题，由于拟除虫菊酯类农药环境残留时间较长,对于一些非目标生物如蜜蜂、家蚕及其他有益昆虫毒性较大,对鱼、虾、蟹、贝等水生生物毒性也很高，易对生态环境带来破坏。

[16,17]第一代菊酯类农药的稳定性较差，只能作为卫生杀虫剂使用，如烯丙菊酯、环虫菊酯、苯醚菊酯等。

第二代菊酯含有卤素较第一代稳定，如溴氰菊酯、吡氯氰菊酯、氟氯菊酯等[18]。

1.1.6除草剂（Herbicide）

目前，除草剂的使用很广泛，品种逐渐增多，使用较多的除草剂以苯氧羧酸、二苯醚酰胺、氨基甲酸酯、取代脲、有机磷、三氮苯和磺酰脲类等为主[19]。

虽然，多数除草剂对人畜的急性毒性较低，但是，除草剂的使用，会使杂草产生抗

药性，加大了除草剂的用量，通过植物吸收，进行降解和蓄积后，会给人类以及动物器官组织带来病变[20]。

1.2蔬菜中农药残留现状

蔬菜是生活中必不可少的,随着人民生活水平的提高，人们越来越注重蔬菜的质量，不只关注蔬菜的营养成分，同时蔬菜可能存在的污染问题也越来越受到人们的重视[19,20]。

农药残留和亚硝酸盐，重金属等是蔬菜污染的主要来源[21]。

使用农药后，一定时期内残留于环境及农产品中的微量农药原体、及其有毒降解物，代谢产物等，被称为农药残留。

农药施于农作物，其中10%~20%的农药散落到了大气、水和土壤中[19,22]，农作物还可通过根和叶吸收、传导以及降水等途径，将环境中的微量农药再转移到作物体。

而人类食用这些带有农药残留的农作物，一是可能会因为高毒农药，直接引起中毒，甚至死亡；二是农药残留在体内慢慢积累，最终会导致慢性中毒。

蔬菜中常见的农药残留主要有有机磷农药和氨基甲酸酯类农药两大类，如乐果、敌百虫、敌敌畏、内吸磷、对硫磷、西维因、马拉硫磷、涕灭威等[23]。

据相关部门统计分析，我国目前农药的年用量是世界首位，有70%蔬菜被有剧毒的有机磷类农药污染过。

近年来，农产品农药残留污染问题严重，由于误食高农药残留量的蔬菜而出现的食物中毒现象越来越多，甚至还因农药残留超标而限制了蔬菜出口，这对人民的生命安全、身心健康以及我国对外农业贸易的发展产生了严重影响[19,24]。

蔬菜中农药污染严重，一方面是由于80年代以来，随着大棚、温室蔬菜种植面积的增加，连作、重茬使蔬菜病虫害越来越严重，而农药的大量使用，普遍使蔬菜上的病虫害对农药产生了抗药性，因此农药的使用出现了恶性循环，农药残留也越来越严重。

另一方面，在利益的驱动下，由于农民素质参差不齐，相关部门对农药的监控力度不够等问题，违禁农药的非法使用更是加剧了农药残留问题[25]。

近几年，虽然在各级政府的监管下，蔬菜中农药残留问题得到了一定遏制，但由于蔬菜中农药不合理使用，生产经营的分散性，生产技能不能适应蔬菜生产的新要求，使农药残留超标问题依然存在。

随着蔬菜质量安全的监控，蔬菜中残留农药种类已发生了变化，中低毒农药、非禁用农药逐渐成为蔬菜农药残留问题的新方向[25,26]。

我国蔬菜中农药最大残留限量标准和检测方法标准仍不完善，而欧美国家农产品中农药残留的检出率和超标率在逐年下降，农产品质量大幅度提高，农药残留的现象得到了有效遏制，农药残留检出限和最高检出限日益下降。

我国加入WTO后，因为农药残留超标问题，欧美各国对我国农产品出口树起了贸易壁垒，我国农产品出口的形势不容乐观。

因此,为了减少农药残留对环境和人体造成的危害，确保农产品的质量，必须加强对农残留量的分析，这对于加强农药管理，指导安全、科学、合理得使用农药，保障人体健康，防止农药污染农产品及环境，安全生产无公害食品具有极其重要的意义，为进一步优化国家农药安全使用准则提供科学理论依[26,27]。

1.3农药残留物的检测方法

1.3.1色谱法

薄层色谱法（TLC）

薄层色谱法先用适宜的溶剂提取，经过纯化浓缩后，在薄层硅胶板上分离展开，经过显色后，与标准比较Rf值进行定性测定，用薄层扫描仪进行定量测定，是一种较广应用的快速微量检测方法,。

气相色谱法（GC）

由于气相色谱法具有操作简便、灵敏度高、分析速度快、分离效果好、应用范围广、一次进样可以对多个有效成分进行测定等特点，目前农药残留物检测70%采用气相色谱法进行。

其中应用于有机磷检测的检测器主要有火焰光度检测器（FPD），氮磷检测器（NPD）、电子捕获检测器（ECD）。

高效液相色谱法（HPLC）

液相色谱法具有分离效能好、灵敏度高、检测速度快及重现性好等特点，与气相色谱比较，尤其适用于高熔点化合物、热分解农药和水溶性农药的检测。

HPLC检测限比GC高，由于其只能检测对紫外有吸收和本身能发射荧光的农药,限制了HPLC法的使用。

气相/液相色谱-质谱联用（GC/HPLC-MS）

质谱分析法是先将被测样品离子化，再根据不同离子在电场或磁场中不同的运动形式，把不同离子按照不同的质荷比（m/z）分开。

通过样品的离子流色谱、质量色谱提供的信息，可以实现定性、定量分析。

与气相/液相色谱联用，具有

灵敏度高、分析速度快、定性能力强的特点，即使农药化合物没有完全被分离，也可以通过分子量的不同而得到定性。

超临界流体色谱（SFC）

超临界流体色谱技术是20世纪80年代兴起的，以高于临界温度和临界压力的超临界流体作为色谱的流动相，进分离、纯化、分析的前处理方法。

由于其传质阻力小、相对温度低、扩散系数，可以对大分子化合物、热不稳定化合物、高聚物等进行快速分析。

超临界色谱可与各种气相、液相色谱检测器匹配，也可与红外、质谱联用。

通过调节压力、温度、流动相等条件，实现多重梯度,选择最佳的色谱条件。

超临界流体色谱综合利用了气相色谱和高效液相色谱的优点,克服了各自的缺点，成为一种强有力的分离和检测手段。

1.3.2生物传感检测法

酶抑制法（EI）

有机磷和氨基甲酸醋类农药对胆碱醋酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度正相关，通过加入底物，测定对酶的抑制率，与标准对比，可以对样品中农药进行定性定量分析。

中国农药残留快速检测主要采用酶抑制技术，如酶液比色法、pH测定法和纸片速测法等[30,32]。

酶联免疫吸附分析法（ELISA）。

ELISA是把抗原、抗体相互反应中的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来的一种检测技术，这种技术通过一定使抗体（抗原）与酶结合在固相载体表面，以待测物为抗原（抗体）。

加入待测物后，抗体与抗原特异性结合后离去，通过测定酶的减少，来对待测物进行定性、定量分析。

酶联免疫分析方法检测有机磷农药残留的检测方法的特异性强，精确度高,灵敏度高，方便快捷，但其制作周期长，过程复杂[30,33,36]。

生物传感器法（EBS）

酶作为敏感元件，由具有底物识别功能的固定化酶层和可以转换信号的转换器组成。

底物经过酶催化转化，再经过检测器检测,通过转换器转换为可识别的信号，从而达到了检测的目的[34,37]。

1.3.3红外光谱分析技术

近红外光谱和表面增强拉曼光谱，使光谱分析的灵敏度提高了102~107倍。

这些快速、直接的光谱技术，只需要极少量样品，具有很大应用潜力，其灵敏度几乎达到了一个分子甚至一个原子的水平[28,29]。

1.3.4毛细管区带电泳（CIE）

以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析方法，是现代分析化学研究的前沿领域之一。

它利用液体介质中的带电粒子在电场作用下迁移速度不同而进行分离的方法。

毛细管区带电泳法非常适用于离子化样品的分析和分离，尤其是那些难以用传统的液相色谱法分离的样品[31,35]。

大型仪器分析法灵敏度高、选择性好、结果准确可靠，因此现行的有机磷农药残留检测标准方法为大型仪器检测法。

但是色谱检测的仪器价格昂贵、大型，样品的前处理过程繁琐，需要专业人员进行操作并且检测耗时多等缺点也使得该项技术只能用于实验室及专业的检测机构而不能得到很好的普及。

研究适合我国农作物和果蔬产销特点的快速、灵敏、准确的检测技术和方法是控制当前农药残留的关键技术措施。

农药残留快速检测技术由于其操作简单、快速,成本较低等优点，可以对农产品生产和销售实现实地实时检测，世界各国在农药残留快速检测领域都投入了极大的资金和技术[35,37]。

1.4农药前处理方法汇总

1.4.1振荡法（OE）

经典的前处理方法，广泛应用于农药残留分析中。

我国国家标准GB/T5009系列就是丙酮为萃取溶剂，进行农药提取分离的，振荡法若使用单一非极性溶剂，植物组织包裹农药分子，萃取溶剂不能有效与溶剂接触，造成萃取率较低，因此，一般采用丙酮，乙腈等萃取溶剂，或者使用混合溶剂来进行农药的萃取。

[38-40]

1.4.2液液萃取（LLE）

液液萃取是传统的前处理方法，也是目前应用最广泛的农药前处理技术。

液液萃取利用待测组分与杂质在两个互不相容的溶剂中的分配系数不同而达到分离纯化。

液液萃取虽然实验器材要求低，但也存在多方面的缺点，一方面对溶剂要求高，既要提取待测组分，有要使待测组分与杂质进行分离，另一方面传统的

液液萃取，操作繁琐，多次萃取，耗时长，样品流失大，重现性不好，且溶剂消耗量大，易造成溶剂浪费和环境污染[38,39,40]。

1.4.3超声波提取（UAE）

由于，超声波萃取，不需要加热，与其他方法联用，能大大提高萃取率，缩短萃取时间，被广泛应用于食品、药物、工业原材料、农业环境等各行业中。

但超声波辅助提取，一般消耗溶剂量较大，萃取不够均匀，实验重现性较差[38,39,40]。

1.4.4加速溶剂