细胞生物学实验考考试样题及实验思考题答案.docx
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细胞生物学实验考考试样题及实验思考题答案
细胞生物学实验考试样题
一、填空题（2分/每空，共30分）
1、洗液由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水组成。
2、1640培养基包括RPMI1640培养液、谷氨酰胺、双抗、小牛血清。
3、鉴别活细胞的染液是0.4%台盼蓝溶液;鉴别细胞核的染液是甲基绿-派洛宁染液；鉴别线
粒体的染液中性红-詹纳斯绿染液。
4、细胞核分离的基本步骤是组织匀浆、离心、纯化、鉴定。
5、细胞骨架中使蛋白质被保存的染料是1%Triton-100。
二、简答题（5+5+10共20分）
1.线粒体在分离提取过程中，为什么要在0~4℃中进行？
答：
①为了保持组分的生理活性;
②防止线粒体中的酶被破坏，避免酶失活
2.什么我们在检测细胞渗透性时要用一定浓度的试剂？
答：
①确保实验是在等渗条件下进行；
②防止物质的进出；
③同时避免由于渗透压不同而影响实验结果。
3.细胞的计数步骤和方法。
答：
加等体积的染液与细胞悬液混合～把悬液滴在计数板上～底倍镜下观察，活细胞无色，死
细胞为蓝色，找计数方格计四个方格的细胞总数。
（压到大格线者“计左不计右，计上不计下”）计算。
Ⅰ：
每毫升原液细胞数=4个大格细胞总数/4*100*稀释倍数
Ⅱ：
细胞存活率（%）=（细胞总数-死细胞数）/细胞总数。
细胞生物学实验思考题答案
实验一利用各种显微镜观察细胞形态、结构
1、简述显微镜的主要结构和操作要领。
普通生物显微镜由3部分构成：
1照明系统：
包括光源和聚光器。
2光学放大系统：
由物镜和目镜组成，是显微镜的主体。
③机械装置：
用于固定材料和观察方便，包括镜台（载物台）、调节器和物镜转换器（旋转器等
使用
（一）、观察前准备
检查：
底座右侧的光源亮度旋钮是否在“1”位置，即顺时针选到最底位。
开机：
①.打开后座主电源开关——绿色按钮
②打开后座CCD电源开关——红色按钮
白平衡调整：
不放切片，在10倍物镜下将电源调整到最亮，然后按底座右方的白平衡按钮（红色）3－5秒之后将光源亮度调回到适中状态。
（二）、观察操作
放上切片，将光源调到自己习惯的亮度。
视度补偿：
调节目镜双筒找到自己的瞳距，此时两眼镜下的图象重合在一起，横拉板上的数字（例如：
64）就是自己的瞳距，然后将两只目镜外侧的刻度线调到瞳距的数字的位置。
调焦：
将绿色光标移至视野中央，开始观察，如需提问，按呼叫按钮
（三）、下课时的操作
①.将光源亮度调到最低“1”刻度。
②.关掉红色CCD电源开关，再关绿色主电源开关。
③.套上显微镜套。
④.耳机及凳放整齐。
2、分析在使用低倍镜、高倍镜和油镜时，对光亮度的要求。
由于从低倍镜到高倍镜的时候视野变暗，物像变大，细胞数目变少，所以光亮度应该调高，但最主要的还是应以自己的视觉舒适为主。
3、分析聚光镜在成像质量中的作用。
聚光镜是在照明光路中的重要组件，用于集中从光源来的光线，是被观察的标本得要明亮和均匀的照明，正确使用聚光镜系统对于发挥显微镜的分辨率和增强像的反差有很大的作用。
实验二显微摄影
1.、要想得到一张完美的显微摄影照片，应注意哪些方面的问题，主要关键是什么？
要获得一张好的显微摄影照片，必须注意满足以下几个条件：
1制作清晰的标本片，其中组织切片应厚薄适度，染色片不应有多余的染料等。
2选择性能优良干净的载玻片和盖玻片。
3使用高性能的物镜（最好用复消色差的平场物镜）和聚光器。
4采用Kohler照明法。
5选择好合适的拍摄胶片。
⑥拍摄时应准确地聚焦和选择合理的曝光时间。
⑦正确的冲印方法。
关键点：
为求得高分辨率的显微影像，须选用复消色差物镜与摄影专用目镜或平周目镜配合。
显微摄影的照明方法，分为透射照明、落射照明（垂直照明）和明视野与暗视野照明。
同时还应注意各种滤色片的选用。
2、结合数码互动显微镜摄影操作，写出操作工程、拍摄关键点以及注意事项。
过程：
用数码显微镜仔细观察样品；利用实验台前面的操作面板上的呼叫按钮请求拍照；得到教师允许后，按操作面板上的拍照按钮进行摄影；将所拍摄到的照片挑选后打印出来。
拍摄关键点：
；注意事项：
每次更换装片时要进行白平衡的调整；要注意对光线的调整；要注意屈光度的调整；摄像时要以从目镜观察到的图像为准。
实验三细胞的亚显微结构观察
1.比较光镜与电镜工作原理的区别。
电子显微镜的高分辨率主要是因为使用了波长比可见光短得多的电子束作为光源，波长一般小于0.1nm,由于光源的不同，又决定了电镜和光镜的一系列不同点：
电镜使用电磁透镜聚焦，光镜使用玻璃透镜聚焦，电镜筒中要求真空而光镜筒中不要求真空，图像需要用荧光屏来显示或用感光胶皮做记录，光镜成像时利用样本对光的吸收形成明暗反差和颜色变化而电镜利用电子的散射和透射形成明暗反差，光镜的分辨率为200nm,而电镜的分辨率为0.2nm.
2、分析扫描电镜与透射电镜的主要异同点。
结构差异：
主要体现在样品在电子束光路中的位置不同。
透射电镜的样品在电子束中间，电子源在样品上方发射电子，经过聚光镜，然后穿透样品后，有后续的电磁透镜继续放大电子光束，最后投影在荧光屏幕上；扫描电镜的样品在电子束末端，电子源在样品上方发射的电子束，经过几级电磁透镜缩小，到达样品。
TEM:
电子的穿透能力很弱，透射电镜往往使用几百千伏的高能量电子束，但依然需要把样品磨制或者离子减薄或者超薄切片到微纳米量级厚度SEM:
几乎不用制样，直接观察；透镜成像的时候是利用电子在样品表面穿透后剩余电子在荧光屏上成像而扫描电镜需要激发出二次电子收集的是二次电子；扫描电镜为了使样品能够激发出二次电子标本在固定脱水后需要喷上一层重金属膜，重金属在电子的轰击之下发出次级电子信号。
相同之处：
固体，尽量干燥，尽量没有油污染，都是电真空设备，使用绝大部分部件原理相同。
实验四细胞膜的渗透性
1.讨论溶血实验在研究中应用的可能性。
比如溶血空斑实验，溶血空斑实验是体外检测B淋巴细胞的一种方法，即将经绵羊红细胞（SRBC）免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，于37℃作用下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。
每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。
由于溶血空斑实验具有特异性高，筛选力强，可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。
有时在提红细胞膜蛋白时要用到，先用低渗溶液让红细胞胀破，高速离心收集、纯化膜蛋白。
实验五动物细胞培养及其生长特性的观察分析
1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
主要应用范围是布类、橡胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液（如Hanks液、PBS、20×SSC等），牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压。
理由：
在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。
在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。
在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
2、紫外线消毒的适用范围和目的是什么？
用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。
通过紫外线的照射,改变及破坏微生物DNA结构,使细菌当即死亡或不能繁殖后代,达到杀菌的目的
3、血清在细胞培养中有何作用？
血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子；酶、微量元素和激素；保护作用；提供伸展和贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。
此外它还能中和有毒物质（重金属、抗菌素）的毒性。
4、为什么配制培养基之前要反复处理配制用水并要事先高压处理？
防止有其他细菌在培养基中生长污染培养基是要培养的对象没能培育出来，而影响实验目的。
是实验产生误差。
5、配制培养基时调节pH值的目的是什么？
因为各种培养物生长时所需的PH值不同，为了保证培养物的正常生长，必须给培养物一个合适的Ph值，才能保证的到产物。
6、细胞传代培养的目的是什么？
通过细胞培养可以得到大量的单一类型的细胞群体i，可以再培养细胞中研究许多不同的细胞活性，包括内吞，细胞运动，细胞分裂，膜运输和大分子合成，细胞在培养中可以分化，以及细胞对各种药物，激素的，生长因子的反应
7、贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不同？
贴壁细胞：
弃去培养液，加胰酶消化，加培养液终止胰酶作用，吹打成悬液，分装传代。
悬浮细胞：
离心，弃上清液，加新鲜培养基，分装传代
8、如何防止传代过程中不被微生物污染？
首先保证被培养细胞处于无菌环境，即对培养液和所用培养工具进行无菌处理，通常在细胞培养液中加入一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。
此外，要定期更换培养液，以便清楚代谢产物，防止细胞代谢产物的积累对细胞自身造成危害。
9、悬浮细胞和贴壁细胞在计数时有何不同？
对于贴壁培养的细胞应该先制成细胞悬浮液，而对于悬浮细胞则可以直接进行计数与计算过程。
10、讨论细胞存活率在研究中的应用和意义。
可以用来实验不同的肿瘤细胞对不同药物的敏感度。
对于人类治疗肿瘤攻克癌症具有很大的贡献意义。
实验六细胞器的分离与观察
1、线粒体提取分离过程中，为什么要在0～4℃进行？
因为在线粒体中的细胞色素氧化酶是之后染色的关键，所以要在低温下保持其生物活性。
否则与詹纳斯绿染色就失败了。
2、将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。
要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问题？
根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。
（1）尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分的生理活性。
最好在0-4摄氏度或冰水浴中进行。
（2）将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时要及时离心，以防匀浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。
（3）染液应在实验时临时配制，效果更好。
3、分离介质0.25mol/L及0.34mol/L缓冲蔗糖溶液哪一种在下层?
有什么作用?
0.34mol/L缓冲蔗糖溶液那种在下层。
悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液,它较接近细胞质的分散相,在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性。
0.25mol/l蔗糖-----采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。
若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。
实验七细胞骨架的观察
1、微丝观察实验中，1%TritonX-100处理细胞的作用是什么？
非离子去垢剂。
1%TritonX-100，破坏膜结构、可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存。
2、微丝观察实验（考马斯亮蓝R250染色法观察微丝）中，是否能看到微管、中间纤维？
为什么？
能，考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比。
由于微丝，微观，中间丝都是由蛋白质组成，所以考马斯亮蓝溶液能够将他们染色，所不同的是电镜下呈现的颜色深浅不同而已。
3、M–缓冲液的作用是什么？
答案：
清洗组织细胞、稳定骨架蛋白，维持细胞的渗透压。
4、说明细胞中由微丝组成的结构及其功能。
能组成细胞表层，应力纤维，细胞伪足、微绒毛和胞质分裂环
功能：
皮层内密布的微丝网络可以为细胞质膜提供强度和韧度，有助于维持细胞的形状，细胞内的多种运动，如胞质环流，阿米巴运动、变邹膜运动、吞噬以及膜蛋白的定位等都与皮层内肌动蛋白的溶胶态活凝胶态转化相关；应力纤维通过粘着班与细胞外基质相连，可发生细胞形态变化，细胞分化和组织建成等方面具有重要作用。
在微丝以及肌动蛋白等的作用下细胞能够通过伪足进行运动；微丝对微绒毛具有支持的作用，小肠上皮细胞的微绒毛能够使吸收物质的表面积增大，增加吸收的速度。
胞质分裂环在细胞分裂的时候随着收缩环的运动，两个子细胞能够被欲裂开来。
实验八细胞凋亡的诱导和细胞凋亡的形态特征的观察
1、总结凋亡细胞的形态特征。
形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的，细胞凋亡往往涉及单个细胞，即便是一小部分细胞也是非同步发生的。
首先出现的是细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后是细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。
2、试述本实验鉴别凋亡细胞、坏死细胞核正常细胞的原理
细胞死亡作为生物体的一种常见现象，一般可分为两种类型：
细胞坏死和细胞程序性死亡（PCD），也称细胞调亡。
细胞程序性死亡分为两类：
受体介导的细胞程序性死亡和线粒体介导的细胞程序性死亡。
调亡细胞的形态学观察：
HE染色、Giemsa染色、台盼蓝染色、改良苯酚品红染色；细胞调亡生化特征的检测：
DNA电泳、细胞膜磷脂酰丝荧光显示、调亡细胞原位末端标记法
3、试述凋亡细胞的生化特征。
（1）DNA的片段化细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体的DNA降解，这是一个较普遍的现象。
细胞凋亡这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数，而这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体与核小体的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段，实验证明，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图谱。
（2）大分子合成细胞凋亡的生化改变不仅仅是DNA的有控降解，在细胞凋亡的过程中往往还有新的基因的表达和某些生物大分子的合成作为调控因子。
如我们实验室发现的TFAR-19就是在细胞凋亡时高表达一种分子，再如在糖皮质激素诱导鼠胸腺细胞凋亡过程中，加入RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂即能抑制细胞凋亡的发生。
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