DNA和蛋白质技术知识讲解及练习.docx

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DNA和蛋白质技术知识讲解及练习

DNA和蛋白质技术

【学习目标】

1、尝试粗提取植物或动物组织中的DNA。

2、理解DNA粗提取与DNA鉴定的原理。

（重点、难点）

3、理解PCR的原理和反应过程。

（重点、难点）

4、掌握提取生物大分子的基本过程和方法。

5、理解凝胶色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理。

【要点梳理】　

要点一、DNA的粗提取和鉴定

1、实验原理【高清课堂：

DNA和蛋白质技术课题1：

DNA的粗提取和鉴定】

（1）DNA粗提取的原理：

①提取生物大分子的基本思路是用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子

②DNA或蛋白质等成分在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同。

③当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随着NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低，在0.14mol/L时，DNA的溶解度最小；当NaCl溶液浓度大于0.14mol/L时，DNA的溶解度随着NaCl溶液浓度的增加而逐渐增加

（2）进一步提纯DNA的原理：

DNA不溶于酒精溶液，但细胞内的某些蛋白质则溶于酒精。

利用该原理，可将DNA与蛋白质进一步分离。

DNA和蛋白质的其他性质：

①蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA不起作用

②大多蛋白质在60~80℃高温下变性，而DNA在高于80℃才变性

③洗涤剂能瓦解细胞膜，但对DNA无影响

（3）DNA鉴定的原理：

在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色

2、实验流程：

（1）实验材料的选取

DNA含量高、易破碎且无颜色干扰的生物组织最好

（2）破碎细胞，获取含DNA的滤液

①动物细胞的破碎及过滤（以鸡血为例）

DNA位于细胞中，要使DNA从细胞内释放出来，必须使细胞破碎。

实验中，通常采用向鸡血细胞液中加入蒸馏水并且搅拌的方法使细胞破碎。

其原理是鸡血细胞在低浓度溶液（蒸馏水）中吸水涨破，同时，搅拌的机械作用也加速了鸡血细胞的破裂（包括细胞膜和核膜的破裂），于是DNA和RNA都释放出来，但它们往往与蛋白质结合在一起。

②植物细胞作为实验材料（如洋葱、菜花等）

如果从植物细胞中提取DNA，则首先要用洗涤剂溶解细胞膜。

如提取菜花细胞中的DNA，在切碎的菜花中加入一定量的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集滤液。

加入洗涤剂可以瓦解细胞膜，从而释放出DNA；加入食盐能够使DNA溶解。

（3）去除滤液中的杂质

滤液中含DNA、RNA和蛋白质等物质。

根据DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度，从而去除杂质。

具体做法是：

在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol／L，过滤除去不溶的杂质，再调节：

NaCl溶液浓度为0.14mol／L，析出DNA，过滤去除溶液中的杂质，再用2mol／L的NaCl溶液溶解DNA。

要点诠释：

去除滤液中的杂质，提纯DNA主要有以下几种方法：

方法一：

利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。

具体做法：

在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液的物质的量浓度为2mol／L（DNA溶解度大），过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl溶液的物质的量浓度为0.14mol／L，析出DNA，过滤去除溶液中的杂质，再用物质的量浓度为2mol／L的NaCl溶液溶解DNA。

方法二：

直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15分钟，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。

方法三：

将滤液放在60℃～75℃的恒温水浴箱中保温10～15分钟（此温度下蛋白质变性析出，DNA不受影响），注意严格控制温度范围。

（4）DNA的析出与鉴定

①DNA的析出

除去了蛋白质的核酸溶液，必须再进一步沉淀和浓缩。

最常用的方法是酒精沉淀法。

即将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液（体积分数为95％），静置2min～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。

用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。

②DNA的鉴定

取两支20mL的试管，各加入物质的量浓度为2mol／L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。

然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。

混合均匀后，将两支试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化，含DNA的试管溶液变蓝。

（5）结果分析与评价

若实验结果不明显，可能的原因是：

①材料中核物质没有充分释放出，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。

②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。

③二苯胺配制时间过长，最好现配现用，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。

要点二、多聚酶链式反应扩增DNA片段

1、实验原理【高清课堂：

DNA和蛋白质技术未发布多聚酶链式反应扩增DNA片段：

实验原理】

细胞内DNA复制过程：

边解旋边复制

（1）条件：

DNA模板、解旋酶、DNA聚合酶等、RNA引物

4种脱氧核苷三磷酸为原料、需要消耗能量

（2）子链合成方向：

5′→3′

要点诠释：

①解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口。

②DNA单链有方向性，DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。

子链合成方向都是5′→3′。

2、PCR过程所需条件

模板：

要扩增的DNA片段

两种引物：

各自5′端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）

DNA聚合酶：

耐高温的TaqDNA聚合酶

原料：

dNTP（4种脱氧核苷三磷酸：

dATP、dTTP、dGTP和dCTP）

3、PCR技术的原理

要点诠释：

PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。

PCR过程可用下图表示：

（1）变性：

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，如下图：

（2）复性（退火）：

系统温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：

（3）延伸：

当系统温度上升到72℃左右（温度为热稳定DNA聚合酶的最适温度），溶液中的四种脱氧核苷酸（A、T、G、C）在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：

4、PCR的实验操作

（1）实验用具

①微量离心管：

它是一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL。

实际上是进行PCR反应的场所。

②微量移液器：

用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体，每吸取一种试剂后其上的一次性吸液枪头都必须更换。

③PCR仪：

该仪器能自动调控温度，实现DNA的扩增。

在实验操作中，用微量移液器，按照PCR反应体系的配方在微量离心管中依次加入各组分，再设计好PCR仪的循环程序就可以了。

如果没有PCR仪，可以设置三个恒温水浴锅，温度分别为94℃、55℃、72℃，在三个恒温水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管即可。

（2）注意问题

PCR技术高度灵敏、极其微量的污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增。

为了避免出现这一现象，PCR操作时要注意做到：

隔离操作区、分装试剂、简化操作程序等：

①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

②PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃下储存。

使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

③在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。

所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。

5.PCR扩增的计算与DNA含量的测定

（1）理论上DNA扩增数目的计算

DNA扩增与DNA复制类似，呈指数扩增。

若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后有2n个；若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。

（2）实验中DNA含量的测定

DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。

可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：

要点三、血红蛋白的提取和分离

1、凝胶色谱法

（1）概念：

是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

即凝胶过滤层析，也称分子排阻色谱法或凝胶渗透层析。

这是根据分子的大小分离蛋白质混合物的最有效的方法之一。

（2）凝胶色谱法的介质：

凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，其内部是多孔的网状结构。

凝胶的交联度或孔度（网孔大小）决定了凝胶的分级分离范围，即能被该凝胶分离开来的蛋白质混合物的相对分子质量范围。

目前经常使用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等。

（3）原理：

凝胶实际上是一些微小的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道。

相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动的速度较慢。

因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离。

（如下图所示）

要点诠释：

蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析：

相对分子量大

相对分子量小

直径大小

大于凝胶颗粒空隙直径

小于凝胶颗粒空隙直径

运动方式

垂直向下运动

无规则的扩散运动

运动速度

较快

较慢

运动路程

较短

较长

洗脱顺序

先从凝胶珠中洗脱出来

后从凝胶珠中洗脱出来

2、缓冲溶液

缓冲溶液是一类能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变的溶液。

该溶液的这种抗pH变化的作用称为缓冲作用。

缓冲溶液通常是由1~2种缓冲剂溶于水配制而成，调节缓冲剂的使用比例即可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

（1）缓冲溶液的组成：

缓冲溶液必须同时含有两种物质，一种是能抵制外加少量强碱的物质，另一种是能抵制外加少量强酸的物质。

①弱酸和弱酸盐组合：

H2CO3—NaHCO3；CH3COOH—CH3COONa。

②弱碱和弱碱盐组合：

NH4OH—NH4Cl。

③多元弱酸的酸式盐和它所对应的次级盐；NaH2PO4—Na2HPO4、KH2PO4—K2HPO4。

（2）缓冲溶液的作用：

在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。

调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

（3）缓冲溶液的配制和pH的测定：

生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外溶液的pH与体内环境中的pH基本一致。

因此，缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义。

3、电泳

（1）电泳概念：

电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

（2）电泳原理：

许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。

电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。

（3）常用方法：

琼脂糖凝胶电泳：

聚丙烯酰胺凝胶电泳

由于琼脂糖本身不带电荷，所以各种分子在电场中的迁移速度因各种分子的带电性质差异、分子大小、形状不同而不同，从而得以分离。

在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小。

4、血红蛋白的提取和分离过程

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

（1）样品处理

①红细胞的洗涤

洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。

采用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，达不到分离的效果。

要点诠释：

a.洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。

b.离心时转速要低，时间要短，一般为500r／min，离心2min。

c.洗涤三次后，如果上清液中还有黄色，可增加洗涤次数。

②血红蛋白的释放：

红细胞在蒸馏水和甲苯的作用下破裂，释放出血红蛋白。

③分离血红蛋白溶液：

将混合液进行离心后，会明显看到试管中的溶液的分层情况：

第3层的红色透明液体是血红蛋白的水溶液。

（2）粗分离——透析

①原理：

透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。

②过程：

取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。

③目的：

除去样品中相对分子质量较小的杂质；用于更换样品的缓冲液。

（3）纯化——凝胶色谱操作

①凝胶色谱柱的装填

装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。

凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发现存在气泡，必须重装。

装填完后，立即用300mL的物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。

要点诠释：

a．商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需要直接放在洗脱液中膨胀。

为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需1h～2h。

这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。

b．在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以减少凝胶颗粒之间的空隙。

一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

二是在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。

②样品的加入和洗脱

调整缓冲液面：

打开色谱柱下端的流出口，调整缓冲液与凝胶面平齐

↓

滴加透析样品：

关闭下端出口，用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端

↓

样品渗入凝胶床：

加样后，打开下端出口，使样品完全渗入凝胶床内

↓

再调整缓冲液面：

关闭出口，小心加入20mmol／L的磷酸缓冲液到适当高度

↓

洗脱：

打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱

↓

收集：

待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集

要点诠释：

a．滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

b．在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。

如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。

（4）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量，是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于相对分子质量的大小，因此可从已知相对分子质量的标准蛋白质的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的相对分子质量。

【典型例题】　

类型一：

DNA的粗提取和鉴定

例1、（2015江苏高考）图1、2分别为“DNA的粗提取与鉴定冶实验中部分操作步骤示意图,下列叙述正确的是（）

A.图1、2中加入蒸馏水稀释的目的相同

B.图1中完成过滤之后保留滤液

C.图2中完成过滤之后弃去滤液

D.在图1鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质

【答案】BCD

【解析】图1加蒸馏水的目的是使鸡红细胞涨破，图2加蒸馏水是为了稀释，A错误。

图1加蒸馏水后，DNA存在于滤液中，B正确。

图2加蒸馏水后，DNA析出，所以弃去滤液，C正确。

嫩肉粉主要是蛋白酶，可以将鸡血中蛋白质水解，D正确。

【点评】本题考查DNA粗提取和鉴定的过程，需思考并梳理实验过程，在理解的基础上识记相关过程。

【举一反三】：

【变式】

下列操作中，对DNA的提取量影响较小的是（）

A．使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA等核物质

B．搅拌时，要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌

C．在析出DNA黏稠物时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中黏稠物不再增多

D．在用酒精沉淀DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却

【答案】B

【解析】题中A、C、D都直接影响DNA的提取量的多少，而B项对提取量相对影响较小，只是使得到的DNA不致断裂。

例2、关于“DNA的粗提取与鉴定”实验：

（1）该实验依据的原理是（）

A．DNA在：

NaCl溶液中的溶解度随NaCl溶液浓度的不同而不同

B．利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNA

C．DNA是大分子有机物，不溶于水而溶于某些有机溶剂

D．在沸水中DNA遇二苯胺会出现蓝色反应

（2）实验的正确操作步骤是（）

A．制备鸡血细胞→提取细胞核物质→溶解核内的DNA→析出并滤取DNA黏稠物→DNA的再溶解→提取较纯净的DNA→鉴定DNA

B．制备鸡血细胞液→提取细胞核物质→溶解并析出DNA→DNA的再溶解→提取较纯净的DNA→鉴定DNA

C．制备鸡血细胞液→溶解DNA→提取细胞核中DNA→DNA的再溶解→提取较纯净的DNA→DNA的鉴定

D．制备鸡血细胞的细胞核物质提取液→溶解并析出DNA→提取较纯净的DNA→DNA的鉴定

（3）实验过程中第一次所用NaCl溶液的浓度是________；第二次所用NaCl溶液的浓度是________；第三次所用NaCl溶液的浓度是________。

所用酒精最好是________，其体积分数为________。

（4）鉴定DNA的方法是，向溶有DNA丝状物的试管中加入________mL的________试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，冷却后可观察到溶液呈________；也可取少许DNA丝状物置于载玻片上，滴一滴________溶液，片刻后用水冲洗，可见丝状物被染成________。

【答案】

（1）A、B、D

（2）A

（3）2mol／L2mol／L0.015mol／L冷酒精95％

（4）4二苯胺浅蓝色甲基绿蓝绿色

【解析】

（1）本实验依据的原理是A、B、D三个方面，必须明确的是当NaCl溶液的浓度为0.14mol／L时DNA的溶解度最低，具体操作时用2mol／L的NaCl溶液，再加水稀释至黏稠物不再增多时，表明该溶液浓度即为0．14mol／L。

（2）A项为正确的操作程序，B项漏掉了DNA的再溶解前要过滤，C项中提取细胞核中DNA的叙述欠妥，应是提取核物质，并且应放在溶解DNA之前，D项明显有误。

（3）整个实验过程三次用到NaCl溶液，第一次是溶解细胞核内DNA，第二次是DNA黏稠物的再溶解；第三次是DNA的鉴定。

前二次所用浓度均是2mol／L。

第三次所用浓度为0.015mol／L。

所用酒精最好是体积分数为95％的冷酒精。

（4）鉴定DNA的存在有两种方法，教材中的二苯胺加热法的优点在于易做对照实验，另一种方法是把甲基绿溶液直接滴在有DNA丝状物的载玻片或玻璃棒上。

呈蓝绿色反应，即证明DNA的存在。

【点评】该实验是高中教材中操作最复杂，要求也是最严格的实验。

类型二：

多聚酶链式反应扩增DNA片段

例3、PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时（）

A．仍与引物I结合进行DNA子链的延伸

B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸

C．同时与引物I和引物Ⅱ结合进行子链的延伸

D．无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链

【答案】B

【解析】考查同学们对PCR反应中的变性、复性、延伸的实质是否理解。

当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物固定端为5＇端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合延伸DNA子链。

【举一反三】：

【变式一】

引物的作用是（）

A．打开DNA双链

B．催化合成DNA子链

C．使DNA聚合酶能够从引物的3＇端开始复制

D．提供模板

【答案】C

【解析】DNA分子的复制具有方向性，即只能从子链的5＇～3＇方向进行复制。

当引物与DNA母链结合后，DNA聚合酶就能从引物的3＇端开始延伸DNA链。

所谓3＇、5＇是指脱氧核糖上C原子的位置。

脱氧核糖的结构图如下图所示。

【变式二】

在PCR实验操作中，下列说法不正确的是（）

A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头

B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢

C．用手指轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合

D．离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果

【答案】A

【变式三】

PCR实验中使用的微量离心管、缓冲溶液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是（）。

A．反复洗涤B．用酒精擦洗C．高压灭菌D．在－20℃储存

【答案】C

【解析】为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。

使用前，将所需的试剂从冰箱内拿出，放在冰块上缓慢融化。

例4、（2015福建高考）GDNF是一种神经营养因子。

对损伤的神经细胞具有营养和保护作用。

研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究。

请回答：

（1）在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是。

（2）构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的限制酶进行酶切。

（3）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：

单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）。

为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选得到的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。

图中第泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。

（4）将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的与提取的蛋白质杂交。

当培养的神经干细胞达到一定的密度时，需进行培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验。

【答案】

（1）使细胞分散开

（2）XhoI（3）

（4）抗体传代

【解析】选

（1）动物细胞培养时，胰蛋白酶或胶原蛋白酶的作用就是溶解胞间联系物质，使细胞使细胞分散开。

（2）由图可知，切目的基因时，质粒上有XhoⅠ识别位点，而且在启动子之后，所以选用XhoⅠ限制酶进行酶切。

（3）泳道①仅有一种条带，属于载体自连；泳道②有两种条带，且长度分别与质粒和GDNF基因长度相同，为正向连接；泳道③有两种条带，长度与BamHⅠ酶切后结果相同，为反向连接。

（4）检测基因是否表达采用抗原抗体杂交法。

然