基因组改组技术简介_精品文档.ppt

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基因组改组技术简介,微生物实验室2012年7月27日,微生物育种方法比较,诱变：

工作量大，效率低，不能定向育种。

基因工程育种：

能实现定向育种，能生产外源蛋白；但是由于次级代谢产物是由微生物细胞内的多酶体系催化完成，多酶体系中的各个酶由分散或连锁的结构基因编码，至今人们仍不能清除了解大多数次级代谢产物合成基因的性质。

因此目前对抗生素产生菌的基因改造，绝大多数仍难以完成。

基因组改组：

融合了前2种方法的优点。

基因组改组发展简史,1994年,Stemmer首先提出了在体外定向进化分子的方法-DNAshuffling技术。

其方法是将同源的DNA用DNAaseI进行消化成片段,然后将得到的随机片段无引物PCR,使之重新随机装配,从而获得了多种排列组合的突变基因库,最后利用设计好的引物PCR,得到预期的重组体。

A-B-C-D-E-F-GA-D-B-G-C-F-E1998年，Stemmer等又提出了genomeshuffling（全基因组改组）,该种方法首先选择一个原始亲株,通过经典的诱变育种方法获得多个表型得到提高的菌株,构建突变候选株文库,以这些表型提高的菌株作为首轮多亲本融合的直接亲株,然后进行多亲株融合,使其全基因组进行随机重组,获得第一代融合株;再从中选择表型获得进一步提高的菌株作为下一轮融合的直接亲本,依此类推进行多轮的多亲株融合,最终从获得的突变体库中筛选出性状被提升的目的菌株。

基因组改组应用实例,在Ying-XinZhang等人的研究中,以4株营养缺陷型的泰乐菌素的生产菌,弗氏链霉菌（Streptomycesfradiae）为模型进行重组进行了一系列实验。

四轮无选择性条件的原生质体融合再生结果表明,后代中带有多重正向进化标记重组子出现的几率是采用原始诱变育种方法的4010万倍。

利用Genomeshuffling经过两轮原生质体融合,历经1年时间、2.4万株的筛选量,所获得的重组株GS1、GS2产泰乐菌素的能力,高于传统诱变方法20年、100万株筛选所获得的菌株SF21的产泰乐菌素的能力。

基因组改组技术可以大幅度地缩短菌株选育周期,同时基因组改组技术采用的递推式重组技术在挑选种群中明显地增大了菌株的进化几率,扩大了变异范围,增加了获得高产突变菌株的机会,原生质体融合技术,原生质体融合技术是一种通过人为的方法，是遗传性状不同的体细胞的原生质体发生融合，并发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗产性状稳定的融合子的过程。

真核细胞和原核细胞都可以进行原生质体融合。

原生质体融合可以在不同种、属、科，甚至更远缘的微生物之间进行。

原生质体制备,主要是在高渗溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性影响原生质体制备的因素

（1）菌体的前处理

（2）菌体的培养时间（3）酶浓度（4）酶处理温度（5）破壁时的ph值（6）渗透压稳定剂,原生质体灭活,为了防止未融合的原生质体再生，采用热灭活或者紫外灭活的方法将原生质体杀死，保证只有融合后的融合子能够再生。

影响原生质体灭活的因素

（1）原生质体的浓度

（2）灭活的温度（3）紫外线的强度（4）紫外照射的距离（5）灭活时间,原生质体融合,制备好的二亲本原生质体可通过融合剂的作用进行融合，融合剂有化学融合剂和物理融合剂。

现在普遍采用的是PEG（聚乙二醇）介导的化学融合法。

影响原生质体融合的因素

（1）PEG

（2）无机离子（3）温度（4）亲株的亲缘关系（5）原生质体的活性（6）细胞浓度,原生质体再生,融合后的原生质体在加稳定剂的再生培养基上能重新形成细胞壁，恢复正常的细胞形态，并能生长繁殖，形成菌落。

影响原生质体再生的因素

（1）菌种本身特性

（2）原生质体制备条件（3）再生培养基成分（4）再生培养条件,基因组改组技术,基因组改组技术是建立在原生质体融合技术基础之上的一种菌种选育新技术，首先选择一个原始亲株，通过经典的诱变育种方法获得多个表型得到提高的菌株，构建突变候选株文库，以这些表型提高的菌株作为首轮多亲本融合的直接亲株，然后进行多亲株融合，使其全基因组进行随机重组，获得第一代融合株；再从中选择表型获得进一步提高的菌株作为下一轮融合的直接亲本，依此类推进行多轮的多亲株融合，最终从获得的突变体库中筛选出性状被提升的目的菌株,Genomeshuffling技术的方法概括,从基因组改组技术的原理来看，进行基因组改组，首先要运用诱变育种的方法，以获得目的性状得到改进的正向突变菌株的基因组库，并作为首轮多亲株融合的直接亲株。

诱变育种的具体操作要根据不同菌种的特性而异。

然后进行多亲株的递推式融合（recursivefusion）。

递推式融合的操作方法与原生质体融合技术基本相同，首先要进行原生质体制备和灭活，随后是原生质体融合、再生、鉴定和挑选等。

谢谢！