不可培养微生物研究进展_精品文档.ppt

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不可培养微生物研究进展,第四组主讲人：

组员：

不可培养微生物的概念,Colwell实验室在1982年提出活的但不可培养微生物的概念，他们发现将霍乱弧菌和大肠埃希菌（简称大肠杆菌）转到不含营养物质的盐水中，经长时间的低温保存，细菌会进入一种数量不减、有代谢活力、但在正常试验室培养条件下不能生长产生菌落的状态，称为活的但不能培养（viablebutnonculturable,VBNC）状态。

其后对多种属细菌进行试验证明，这种不可培养状态是普遍存在的。

自然界中也广泛存在着这种活的但不可培养微生物，在各种生境中仅有小部分的微生物可用实验室方法分离培养，而未被培养的种类却代表了巨大的多样性。

严格说来,这个概念并不严谨。

所谓不可培养,其实应该是在当前认识水平或实验条件下的不可培养。

实际上,通过合适的培养方法,某些细菌是可以实现培养的。

例如在培养基中加人降解过氧化氢的过氧化氢酶或者非酶类的降解物如丙酮酸钠等,可以使处于不可培养状态的大肠杆菌恢复培养。

又比如,一种滕黄色微球菌的自分泌生长因子讨以皮摩尔浓度加人到培养基中,可以提高从腹腔巨噬细胞裂解物中分离感染的结核分枝杆菌的比率其中有部分是不可培养的。

Joseph等发现,通过改进一些简单的培养方法,就可以使实验室培养土壤细菌的种类和数量得到很大的提高。

VBNC细菌的分类,常见的一般情况下实验室条件可以培养的细菌,如霍乱弧菌等,它们在某些条件下能够进人不可培养状态。

是对人工培养有特殊要求的微生物,当改变培养基营养、时间和物理环境,可以培养的微生物。

后者通过提取环境样品中总DNA,构建多元性基因库,对16SrRNA序列分析检测基因来源。

不可培养微生物的研究进展,随着分子生物学、基因工程学的发展,为环境中不可培养的微生物的研究提供了更多新的方法和思路。

本文主要从经诱导进入VBNC状态的细菌的生物学特性、出现条件及检测方法等方面,对VBNC细菌研究进展做一综述。

一、细菌VBNC的诱导因素,在自然环境中,细菌多处于长期的饥饿状态，而进入VBNC状态可以增强细菌在寡营养环境中的存活能力。

当细菌进人不可培养状态后,与其正常培养状态菌体比较,对于高温、高盐以及酸性环境等不利条件有更强的抵抗力,说明某些细菌的不可培养状态是对不利环境的一种适应,有利于细菌在不利环境中生存。

细菌VBNC诱导的具体例子：

低营养诱导的VBNC细胞有霍乱弧菌、痢疾志贺菌、肠球菌、大肠埃希菌、沙门菌等。

P.Mary等3研究了进入VBNC细胞的营养条件,把气单胞菌放在4!

的寡营养的无菌蒸馏水中7周则观察不到可培养菌落的数量,这表明已经进入到了VBNC状态。

如果在25!

培养10周以上,有活力的细胞的数量降低到了0.8对数单位,这时细菌已经进入到了经典饥饿状态,可以观察到缩成球形的VBNC细胞。

大多数文献资料显示,温度是诱导细菌进入VBNC状态最重要的因子,而且温度常和寡养条件协同作用。

S.M.Nelson等4研究表明,在只提供少量氮源、无碳源的情况下E.coli在5!

培养1000h可进入VBNC状态,通过各种方法测定的特定温度下的菌落数的结果是一致的。

温度诱导的VBNC细胞有军团杆菌、创伤弧菌等。

NaCl对多数肠道菌的生长影响较大,徐怀恕等1发现E.coli在25%NaCl环境中培养96h比在5%NaCl下培养同样时间进入VBNC状态的细菌数目高出40倍之多。

此外,氧化、渗透压等因素也可以诱发VBNC状态的出现。

链缩短,青霉素结合蛋白在VBNC阶段消失。

Tholozan8发现,Campylobacterjejuni进入VBNC状态后膜内外pH梯度、膜内K+浓度和膜势能均降低,ATP及ADP浓度降低,30d后仅能检测到AMP存在。

二、细菌VBNC状态的生物学特性,1、VBNC细菌的形态细菌进入VBNC状态后形态会发生改变,大多数的杆菌和弧菌进入VBNC状态后会缩成球状,特别是G-杆菌表现尤为明显。

Signoretto等5研究VBNC状态的G-菌粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）的形态变化时发现其不但没变小,反而有轻微的伸长。

2、VBNC细菌的生理、生化特性细菌进入VBNC状态后,菌体对底物利用减少,核糖体及染色质等物质密度明显降低,细胞质浓缩,蛋白质和脂质总量下降。

ScottARice等6对Vibriovulnificus的核酸分析表明,进入VBNC状态的细胞最初具有完整的DNA和RNA,并具有可恢复正常状态的能力。

随着保持VBNC状态的时间增长,核酸不断降解,其中部分细胞已经不具备恢复正常状态的能力。

CaterinaSignoretto等7分析了E.coliKN126的肽聚糖化学组成的变化,表明二氨基庚二酸交联度（DAPDAP）增加了2倍,胞壁肽共价结合脂蛋白的量增加,肽聚糖链缩短,青霉素结合蛋白在VBNC阶段消失。

Tholozan8发现,Campylobacterjejuni进入VBNC状态后膜内外pH梯度、膜内K+浓度和膜势能均降低,ATP及ADP浓度降低,30d后仅能检测到AMP存在。

3、VBNC细菌的致病性研究表明,病原微生物进入VBNC状态并不代表它们失去致病能力。

Colwell等9证实,注射VBNC状态的Vibriocholerae仍能导致测试人员腹泻,同时发现此菌在进入VBNC状态28d后,仍能产生霍乱毒素,PCR检测说明产生霍乱毒素的基因仍然存在。

W.Baffone等10将进入VBNC状态的VibrioparahaemolyticusATCC43996注入Balb/c小鼠肠管内结扎,分别在第2、4、8和12天解剖2只小鼠进行尸检,结果表明50%的小鼠被感染。

Rahman、M.Habibur等11将VBNC状态的Aeromonashydrophila注入金鱼体内,发现VBNC状态下细菌仍能感染金鱼,但毒性较弱。

VBNC状态的致病菌大多保有毒性,只是随着进入VBNC的时间延长,其感染性减弱,但是由于VBNC致病菌很难检测和防御,因此需要进一步的研究。

总结了已报道的进入VBNC的致病菌的种类及其诱导因素,见下表。

已报道的进入VBNC状态的致病菌的种类及诱导因素细菌种类诱导因素肠炎沙门菌（Salmonellaenteritidis）温度、营养盐缺乏伤寒沙门菌（S.typhi）营养盐缺乏鼠伤寒沙门菌（S.typhimurium）温度、营养盐缺乏、可见光、盐度痢疾志贺菌（Shigelladysenteriae）温度、营养盐缺乏福氏志贺菌（S.flexneri）-宋内志贺菌（S.sonnei）-霍乱弧菌（V.cholerae）温度、营养盐缺乏、渗透压副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）温度、营养盐缺乏创伤弧菌（V.vulnificus（types1&2）温度、营养盐缺乏、盐度肠出血性大肠埃希菌（EHEC）温度、可见光、紫外线、盐度、渗透压、腐殖酸空肠弯曲菌（C.jejuni）温度、营养盐缺乏、曝气、高压氧幽门螺杆菌（Helicobacterpylori）温度、营养盐缺乏肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）营养盐缺乏单核细胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes）-嗜肺军团菌（Legionellapneumophila）温度、杀生素、生物因子结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）-铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）温度、营养盐缺乏,4、复苏VBNC状态作为细菌的一种存活机制,应该具有再次复苏为可培养状态的能力。

Oliver和Collwell等12在滤膜围隔（滤膜漫射围隔实验）中接种细菌后分别置于河口或近海水体中,定期取样检测,发现低温时细菌快速进入VBNC状态,而VBNC细菌在较高温度下则迅速恢复到完全可培养状态（24h内）。

HinchungWong等13研究了在低盐培养基上Vibrioparahaemolyticus的复苏,表明MMS0.5%的NaCl培养基抑制细胞的增殖,但是当把温度设定为25!

而不是37!

时,Vibrioparahaemolyticus可以成功复苏。

MatthewJ.Higgins等14用定量PCR的方法测定在消化和脱水的不同阶段大肠埃希菌数目变化的情况,证实部分VBNC菌株恢复了可培养的特性。

Mukamalova等1516对Micrococcusluteus分泌的一种蛋白（Rpf）进行了研究,Rpf可以在低浓度的培养基上形成,促进菌体的复苏。

三、VBNC的检测方法,VBNC细菌的检测包括总菌数检测、活菌数检测和可培养活菌数检测,因为只有可培养菌数为零而活菌数不为零的细胞才可以判断它进入了VBNC状态。

目前报道的VBNC的检测方法主要有经典方法、分子生物学方法、呼吸检测法、死/活菌检测试剂盒、荧光抗体染色法（FAC）、放射自显影技术等。

经典方法是指吖啶橙染色荧光直接计数法（AODC）、活菌直接镜检法（DVC）和平板直接计数法（HPC）。

1、吖啶橙染色计数法（AODC）对VBNC细菌的计数,目前最常用的方法是吖啶橙染色计数法。

其原理是吖啶橙可以使完整的双链DNA发绿色荧光,使断裂的单链DNA发橘红色荧光,并且能使染色的细胞与背景分开。

但是这种方法不能用来区分活菌和死菌,一般只用做总菌计数。

2、活菌直接计数法（DVC）测定活性更具有说服力的方法是活菌直接计数法。

在培养基中添加少量酵母浸膏等营养物和少量萘啶酮酸（DNA合成抑制剂）培养6h,25!

DNA复制被抑制,细胞也不进行分裂,但是活菌可以进行蛋白质的合成,因此细胞会变长,这成为活细胞的一个标志。

然后用吖啶橙染色,在荧光显微镜下观察计数17。

然而此法却不适用于革兰阳性菌,因为阳性菌对萘啶酮酸有强烈的抵抗力,这也是VBNC研究尚未在阳性菌中大量开展的主要原因之一。

目前改良DVC法应用具有DNA多聚酶的抑制作用的药物替代萘啶酮酸,扩大了细菌VBNC状态的研究范围,Besnard18就采用了环丙沙星,有效地区别了李氏杆菌的死菌与活菌。

3、间接免疫荧光抗体染色计数法（IFAT）间接免疫荧光抗体染色计数法是通过抗血清加荧光抗体染色后,使细胞与背景相区别,然后在荧光显微镜下计数,进入VBNC状态的细菌保持着和正常细菌一样的表面抗原,因此可以利用免疫技术对它们进行检测。

徐怀恕等19用间接免疫荧光抗体染色计数法检测VBNC的副溶血性弧菌。

该法具有操作简便,特异性强,重复性好等优点。

4、分子生物学方法分子生物学技术是直接从样品中提取总DNA,中间没有任何筛选性的过程,因此所得DNA能够准确地反映样品中微生物的实际情况,包括基因探针、分子杂交和PCR等,可以检查样品中含量极微的总菌量。

PCR对于环境当中细菌量较少的样品比较有效。

Koch等20曾经用PCR通过对粗的含菌底物的扩增反应检测10g中含有一个霍乱弧菌的样品。

更早的时候,Shirai等21报道用PCR的方法检测粪便中的V.cholerae01肠毒素操纵子。

使用PCR方法可以证明VBNC菌的存在,也可以结合DVC和荧光标记单克隆抗体的方法进行检测。

5、放射自显影方法放射自显影术用于检测样品中能进行新陈代谢的活菌量。

放射自显影术其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内,经过一段时间后,将标本制成切片或涂片,涂上卤化银乳胶,经一定时间的放射性曝光,组织中的放射性即可使乳胶感光,它是利用卤化银乳胶显像检查和测量放射性的一种方法。

Shahama等22使用3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷,对幽门螺杆菌在水环境中的存活情况进行了研究,通过放射性