丁酸钠诱导人骨髓增生异常综合征细胞株SKM.docx
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丁酸钠诱导人骨髓增生异常综合征细胞株SKM
丁酸钠诱导人骨髓增生异常综合征细胞株SKM
【摘要】本研究探讨细胞外信号调节激酶通路在丁酸钠(NaB)诱导人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1分化中的作用,阐明丁酸钠诱导SKM-1细胞分化的分子机制。
用Westernblot方法检测总ERK和磷酸化ERK的表达水平;将ERK特异性的抑制剂PD98059与丁酸钠联合应用,观察它们对SKM-1细胞生长曲线的影响及分化效应,并用Westernblot方法检测P21和组蛋白脱乙酰酶蛋白质的表达水平。
结果表明:
SKM-1细胞经1mmol/L的丁酸钠作用后,总ERK的表达水平未发生变化,而磷酸化ERK的表达水平下降;丁酸钠及丁酸钠+PD98059均可以上调P21和HDAC蛋白质的表达水平,且丁酸钠联合PD98059的作用强于丁酸钠单用。
结论:
ERK通路抑制是丁酸钠诱导SKM-1细胞分化的重要分子机制。
【关键词】丁酸钠
ERKPathwayChangeintheDifferentiationofHumanMDSCellLinesSKM-1InducedbySodiumButyrate
AbstractThestudywaspurposedtoinvestigatetheroleofextracellularsignal-regulatedkinase(ERK)pathwayinthedifferentiationofhumanMDScelllinesSKM-1inducedbysodiumbutyrate(NaB),andtoelucidatethemolecularmechanismofdifferentiationinSKM-1cellsinducedbyNaB.TheexpressionlevelsoftotalERKandphosphorylated-ERKweredeterminedbyWesternblot.TheeffectofNaBincombinationwiththeERKinhibitorPD98059ontheproli-feration/differentiationofSKM-1cellswasstudied,andthentheexpressionlevelsoftheP21andHDACproteinweredetectedbyWesternblot.TheresultsshowedthattheexpressionlevelofphosphorylatedERKwasdown-regulatedbythe1mmol/LNaB,andtheleveloftotalERKhadnotchanged.NaBorcombinationoftheMEKinhibitorPD98059withNaBcouldincreasethedifferentiationoftheSKM-1cellsandup-regulatedthelevelsoftheP21andHDACprotein,buttheeffectofcombinationofNaBwithPD98059washigherthanthatofNaBalone.ItisconcludedthattheinhibitionofERKmaybeinvolvedinsodiumbutyrateinducingdifferentiationinSKM-1cells.
Keywordsdifferentiation;SKM-1;sodiumbutyrate;ERK
大量研究显示,肿瘤细胞分化与丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)信号转导途径密切相关。
MAPK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可被多种刺激所活化,活化后可磷酸化核转录因子和其它蛋白激酶等多种底物,调节相关基因的转录,进而参与细胞生长、发育、分裂等多种生理过程。
细胞外信号调节激酶与NaB应用时均用RPMI1640稀释到工作浓度。
PD98059、NaB及DMSO均购自Sigma公司,RPMI1640和胎牛血清购自Gibco公司。
药物对细胞生长影响的检测
将对数生长期SKM-1细胞以2×105/ml浓度接种于6孔培养板上,PD98059以5、10和15μmol/L加入培养体系中,分为3组,然后每组再分为加和不加NaB(1mmol/L)组,PD98059提前1小时加入培养基中。
每种药物浓度设平行3孔,培养4天后取样进行台盼蓝染色,光镜下计数,连续3次。
氮蓝四唑(NBT)还原试验
将对数生长期SKM-1细胞以2×105/ml浓度接种于6孔培养板上,分为NaB组、PD98059组、NaB+PD98059组及对照组(未加任何药物处理)组。
NaB的浓度为1mmol/L,PD98059的浓度为5μmol/L,PD98059提前1小时加入培养液中,作用5天后,收集细胞,用RPMI1640液洗涤2次,再用2mlRPMI1640液重悬细胞,内含%NBT,100ng/mlPMA(Sigma公司),37℃温育20分钟后,离心弃上清,加入100μlDMSO溶解沉淀,在光镜下观察胞浆含有灰蓝色颗粒的细胞(阳性细胞),计数200个细胞,计算阳性细胞百分率。
Westernblot分析
丁酸钠对SKM-1细胞ERK蛋白表达的影响
收集1mmol/LNaB作用不同时间后的各组SKM-1细胞,PBS洗2次,用三去污试剂提取总蛋白质,Bradford方法测定蛋白质浓度,取等量蛋白质采用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行分离,然后转至PVDF膜上;室温下摇动封闭2小时后,加入鼠抗-ERK1/2磷酸化抗体(Calbiochem产品,1∶1000稀释)和抗-ERK1/2抗体,4℃过夜;室温下洗膜后加入辣根过氧化物酶偶联兔抗鼠IgG,最后用化学发光底物进行发光显迹。
丁酸钠和PD98059P21对SKM-1细胞P21和HDAC的表达的影响
实验分为PD98059组、NaB+PD98059组及对照组(未加任何药物处理),NaB的浓度为1mmol/L,PD98059的浓度为5μmol/L。
PD98059提前1小时加入培养基中,作用36小时后,收集细胞。
用三去污试剂提取总蛋白质后测定浓度,垂直电泳进行分离之后转至PVDF膜上,封闭2小时之后,加入鼠抗人P21单克隆抗体和兔抗人HDAC多克隆抗体(均购自为SantaCruz公司,1∶1000稀释),4℃过夜,室温下洗膜后加入辣根过氧化物酶偶联兔抗鼠IgG或辣根过氧化物酶偶联羊抗兔IgG,显迹。
统计学处理
两组间连续变量比较用t检验,多组间连续变量比较用方差分析,协方差校正,以均数±标准误(X埂繱E)表示。
结果
药物对SKM-1细胞生长的影响
PD98059可以抑制SKM-1细胞的生长。
组2(5μmol/LPD98059)、组3(10μmol/LPD98059)及组4与组1(未加任何药物处理)比较,SKM-1细胞的数目明显减少,有显着差异性();而组2、组3及组4之间差异性不显着()(图1)。
因此在下面的研究中我们选用5μmol/LPD98059处理细胞。
PD98059与NaB有协同性,同时应用对细胞生长的抑制明显增加。
同一浓度梯度的PD98059,加用丁酸钠对SKM-1细胞的抑制均明显增加()(图1)。
氮蓝四唑(NBT)还原试验
SKM-1经NaB、PD98059及NaB+PD98059处理后,NBT还原试验发现阳性细胞百分率均较对照组明显增加(),两药联用的阳性细胞百分率明显高于单用()(图2)。
丁酸钠对SKM-1细胞ERK蛋白表达的影响
Westernblot检测表明,SKM-1细胞经1mmol/L的NaB作用后,总ERK1/2的表达水平未发生变化,而磷酸化ERK1/2的表达水平在6、12、36小时逐渐减少,说明NaB在其促SKM-1分化的过程中存在着一个持续去磷酸化的过程,ERK的活性受到抑制。
由此推测,NaB可能是通过抑制了ERK1/2信号传导诱导SKM-1细胞分化(图3)。
丁酸钠和PD98059对SKM-1细胞的P21和HDAC表达的影响
Westernblot检测表明,SKM-1细胞经1mmol/LNaB及1mmol/LNaB+5μmol/LPD98059作用36小时后,P21和HDAC蛋白质的表达水平上升,且NaB+PD98059的作用强于NaB单用(图4)。
讨论
ERK属于MAPK超家族的经典成员,其在一系列反应如生长因子和有丝分裂等刺激中被激活,同时其持续活化最终促进细胞增殖和恶性转化;相应地,ERK的下调则可促进细胞生长和生长刺激基因转录的抑制。
因此,丁酸钠抑制ERK转导通路可能是癌细胞在生物化学和形态方面逆转为良性表型的一个重要分子机制。
在本项研究中发现:
SKM-1细胞经1mmol/L的丁酸钠作用后,总ERK蛋白的表达水平无明显变化,而磷酸化ERK明显下降,说明丁酸钠在其促SKM-1分化的过程中存在有一个持续去磷酸化的过程,丁酸钠可能是通过抑制了ERK1/2信号传导诱导SKM-1细胞分化的。
应用ERK的特异性抑制剂PD98059作用于SKM-1细胞,与丁酸钠在抑制细胞生长和诱导细胞分化方面有协同作用,且可上调HDAC和P21的表达水平,也进一步说明了丁酸钠是通过抑制了ERK1/2诱导SKM-1细胞分化。
而Witt等[4]在K562红白血病细胞株中的研究表明,丁酸盐诱导K562向红系细胞分化时有ERK通路抑制和P38通路激活的参与。
Yen等[5]的研究表明,维甲酸在诱导白血病细胞向髓系细胞分化中选择性地激活了ERK2,而不激活JNK/SAPK或P38。
Nagata等[6]的研究结果则提示,P38和JNK的活化对于促红细胞生成素诱导白血病细胞向红细胞分化是必需的。
这可能与ERK1和ERK2广泛存在,在某种程度上它们被多种配体和细胞外界刺激所激活,具有细胞种类特异性有关[7]。
本实验的研究结果表明,ERK通路抑制是丁酸钠诱导SKM-1细胞分化的重要分子机制,然而细胞内存在着不同的信号通路,一定数量的信号蛋白以联合的方式相互作用,构成复杂的细胞内信号网络调控着不同的细胞生物学反应。
是否还有其他的通路参与丁酸钠对SKM-1细胞的分化作用,尚需进行更深入的研究。
【参考文献】
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3李春蕊,刘文励,黄梅等.丁酸钠联合全反式维甲酸对MDS细胞株SKM-1的诱导分化作用及其机制初步探讨.中国实验血液学杂志,2004;12:
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4WittO,SandK,PekrunA.Butyrate-inducederythroiddifferentiationofhumanK562leukemiacellsinvolvesinhibitionofERKandactivationofp38MAPkinasepathways.Blood,2000;95:
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5YenA,CheringtonV,SchaffhausenB,etal.Transformation-defectivepolyomamiddleTantigenmutantsdefectiveinPLCgamma,PI-3,orsrckinaseactivationenhanceERK2activationandpromoteretinoicacid-induced,celldifferentiationlikewild-typemiddleT.ExpCellRes,1999;248:
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6NagataY,TakahashiN,DavisRJ,etal.Activationofp38MAPkinaseandJNKbutnotERKisrequiredforerythropoietin-inducederythroiddifferentiation.Blood,1998;92:
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7LewisTS,ShapiroPS,AhnNG.SignaltransductionthroughMAPkinase CancerRes,1998;74:
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