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第四章第四章反向遗传学及其相关技术反向遗传学及其相关技术一、概述一、概述

（一）遗传研究的二条途径

（一）遗传研究的二条途径1、表、表里：

里：

正向遗传学研究正向遗传学研究杂交或诱变杂交或诱变表型观察表型观察遗传规律遗传规律确定存在确定存在的基因及数目的基因及数目基因的功能及作用性质。

基因的功能及作用性质。

这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究这一途径是从生物体的性状、表型变化来研究遗传物质的组成、分布与传递规律，属于正向遗传物质的组成、分布与传递规律，属于正向遗传学采用的研究方法。

遗传学采用的研究方法。

2、里里表：

表：

反向遗传学研究反向遗传学研究在在已已知知DNA序序列列的的基基础础上上，通通过过DNA重重组组、定定点点突突变变、插插入入/缺缺失失等等遗遗传传修修饰饰手手段段创创造造突突变变体体并并研研究究突突变变所所造造成成的的表表型型效效应应，从从而而研研究究基基因因的的生生物物学学功功能能，阐阐明明生生命命的的本本质质现现象象与与规规律。

律。

与反向遗传学相关的遗传操作技术为反向遗传与反向遗传学相关的遗传操作技术为反向遗传学技术。

学技术。

（二）

（二）RNA病毒的反向遗传学病毒的反向遗传学n采采用用病病毒毒的的遗遗传传材材料料，在在培培养养细细胞胞或或易易感感宿宿主主中中重重新拯救出活病毒或类似病毒物质。

新拯救出活病毒或类似病毒物质。

n能能够够拯拯救救病病毒毒的的遗遗传传材材料料称称为为感感染染性性克克隆隆，一一般般是是在在细细菌菌质质粒粒中中含含有有整整个个病病毒毒基基因因组组的的cDNA拷拷贝贝，使使得得cDNA本本身身或或从从cDNA体体外外转转录录所所得得的的RNA具具有感染性。

有感染性。

nRNA病病毒毒的的反反向向遗遗传传系系统统通通过过定定向向修修饰饰病病毒毒的的基基因因组组序序列列，检检测测被被拯拯救救的的人人工工改改造造病病毒毒的的表表型型，可可以以在在体体内内（invivo）有有效效地地研研究究病病毒毒基基因因结结构构、功功能能和病毒和病毒-宿主相互作用。

宿主相互作用。

nRNA病毒的反向遗传操作病毒的反向遗传操作RT-PCR构建构建RNA病毒的全长病毒的全长cDNA，并进行遗传修饰，并进行遗传修饰与与RNA聚合酶启动子结合聚合酶启动子结合体外转录病毒体外转录病毒RNA转录物转录物RNA感染哺乳动物细胞感染哺乳动物细胞拯救到活病毒拯救到活病毒拯救病毒的表型变化拯救病毒的表型变化病毒基因组的表达、调控、致病机理、病毒基因组的表达、调控、致病机理、病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等病毒与宿主细胞互作、疫苗制造等单正股单正股RNA病毒：

病毒：

RNA聚合酶聚合酶+mRNA+中间型中间型结构蛋白结构蛋白+子代正股子代正股RNA单负股单负股RNA病毒：

病毒：

RNA聚合酶聚合酶+结构蛋白结构蛋白子代负股子代负股RNA逆转录病毒逆转录病毒：

RNARNA/DNA中间体中间体逆转录酶逆转录酶DNA/DNA宿主宿主子代子代RNA正股正股RNA与负股与负股RNA病毒、逆转录病毒病毒、逆转录病毒?

（三）真核生物的反向遗传学（三）真核生物的反向遗传学采采用用反反向向遗遗传传学学鉴鉴定定基基因因功功能能是是真真核核生生物物功功能基因组学的主要内容。

能基因组学的主要内容。

研研究究手手段段包包括括基基因因的的互互补补实实验验、超超表表达达、反反义义抑抑制制、基基因因敲敲除除/基基因因打打靶靶、基基因因陷陷阱阱、基基因激活等手段。

因激活等手段。

利利用用基基因因敲敲除除或或基基因因沉沉默默而而产产生生的的功功能能变变化化研究基因功能是主要的反向遗传学技术。

研究基因功能是主要的反向遗传学技术。

二、反向遗传学相关技术二、反向遗传学相关技术1、基因的同源重组、基因的同源重组2、基因的位点突变、基因的位点突变3、基因沉默、基因沉默基因敲除基因敲除利用利用DNA转化技术，将含有目的基因和靶基因转化技术，将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与同源片段的重组载体导入靶细胞，通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基靶细胞染色体上同源序列间的重组，将外源基因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。

因整合入内源基因组内，使外源基因得以表达。

通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。

遗传特性的改变，达到研究基因功能的目的。

1、基因的同源重组、基因的同源重组完完全全敲敲除除：

通通过过同同源源重重组组直直接接将将靶靶基基因因在在细胞或者动物个体中的活性完全消除。

细胞或者动物个体中的活性完全消除。

条条件件敲敲除除：

将将某某个个基基因因的的修修饰饰限限制制于于特特定定类型的细胞或个体发育特定的阶段。

类型的细胞或个体发育特定的阶段。

完全敲除完全敲除条件敲除条件敲除特定组织特定组织/时间基因敲除时间基因敲除基因敲除基因敲除1）通过同源重组的基因敲除步骤）通过同源重组的基因敲除步骤构建重组载体构建重组载体重组重组DNA转入受体转入受体细胞核内细胞核内筛选目的细胞筛选目的细胞转基因生物转基因生物重组载体的类型：

重组载体的类型：

a）替换性载体系统：

替换性载体系统：

包括同源序列片段、替包括同源序列片段、替换基因的启动子、报道换基因的启动子、报道基因等成分。

基因等成分。

b）插入性载体系统：

插入性载体系统：

插入基因片段插入基因片段（目的基目的基因因）、同源序列片段、同源序列片段、标志基因片段。

标志基因片段。

用替换型（用替换型（a）或插入型（）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验）载体进行完全基因敲除实验2）Res同源重组系同源重组系统统源于源于噬菌体噬菌体Res重组酶的重组系重组酶的重组系统统Ha和和Hb:

同源重组区域同源重组区域Pa和和Pb:

引物位点引物位点sm:

筛选标记筛选标记Red同源重组技术用于基因打靶同源重组技术用于基因打靶3）Cre-LoxP同源重组系统同源重组系统源自源自P1噬菌体的重组系统噬菌体的重组系统属属于于传传统统的的同同源源重重组组载载体体，但但具具有有时时空空调调控控的的功功能能。

该该系系统统由由P1噬噬菌菌体体的的Cre重重组组酶酶和和LoxP位位点点两两部部分组成。

分组成。

nCre重重组组酶酶：

由Cre基因编码，识别LoxP位点，介介导导两两个个LoxPLoxP位位点点（序序列列）之之间间的的特特异异性性重重组组，使使LoxPLoxP位点间的基因序列被删除或重组。

位点间的基因序列被删除或重组。

nLoxP位位点点：

由2个13bp的反向重复序列和1个8bp的间隔区域构成。

Cre酶Cre酶Cre酶CreCre重组酶重组酶13bp的反向重复序列的反向重复序列Cre-LoxP重组系统的特点重组系统的特点CreCrea）Cre重组酶所催化的是一个可逆的重组事件重组酶所催化的是一个可逆的重组事件b）Cre催化重组不需要任何辅助因子的参与催化重组不需要任何辅助因子的参与介导两个同向介导两个同向LoxP位点之间序列的插入位点之间序列的插入/缺失（下左）缺失（下左）介导两个反向介导两个反向LoxP位点之间序列颠倒（下右）位点之间序列颠倒（下右）介导两条含介导两条含LoxP位点位点DNA链的交换或染色体易位。

链的交换或染色体易位。

Cre-Loxpgeneknock-outsystem4）高等动物基因敲除技术高等动物基因敲除技术真真真真核核核核生生生生物物物物基基基基因因因因敲敲敲敲除除除除的的的的技技技技术术术术路路路路线线线线主主主主要要要要包包包包括括括括构构构构建建建建重重重重组组组组基基基基因因因因载载载载体体体体，用用用用电电电电穿穿穿穿孔孔孔孔、显显显显微微微微注注注注射射射射等等等等方方方方法法法法把把把把重重重重组组组组DNADNA导导导导入入入入胚胚胚胚胎胎胎胎干干干干细细细细胞胞胞胞纯纯纯纯系系系系中中中中，使使使使外外外外源源源源DNADNA与与与与胚胚胚胚胎胎胎胎干干干干细细细细胞胞胞胞基基基基因因因因组组组组中中中中相相相相应应应应部部部部分分分分发发发发生生生生同同同同源源源源重重重重组组组组，将将将将重重重重组组组组载载载载体体体体中中中中的的的的DNADNA序列整合到内源基因组中并得以表达。

序列整合到内源基因组中并得以表达。

序列整合到内源基因组中并得以表达。

序列整合到内源基因组中并得以表达。

显显显显微微微微注注注注射射射射命命命命中中中中率率率率较较较较高高高高，技技技技术术术术难难难难度度度度相相相相对对对对大大大大些些些些。

电电电电穿穿穿穿孔孔孔孔法命中率比显微注射低，操作使用方法命中率比显微注射低，操作使用方法命中率比显微注射低，操作使用方法命中率比显微注射低，操作使用方便。

便。

便。

便。

胚胚胚胚胎胎胎胎干干干干细细细细胞胞胞胞（ESES细细细细胞胞胞胞）分分分分离离离离和和和和体体体体外外外外培培培培养养养养的的的的成成成成功功功功奠奠奠奠定定定定了哺乳动物基因敲除的技术基础。

了哺乳动物基因敲除的技术基础。

了哺乳动物基因敲除的技术基础。

了哺乳动物基因敲除的技术基础。

模式动物小模式动物小鼠中完全基鼠中完全基因敲除的步因敲除的步聚聚近交系，白近交系，白色，易产生色，易产生免疫缺陷免疫缺陷2、基因基因的位点突变的位点突变1）点突变）点突变TILLING技术技术TILLING（targetinginducedlocallesionsingenomes）定向诱导基因组局部突变定向诱导基因组局部突变，是一种快速有效地从由化学诱变，是一种快速有效地从由化学诱变剂剂（EMS）诱变过的突变群体中鉴定出点突变的方法。

诱变过的突变群体中鉴定出点突变的方法。

先先用用化化学学诱诱变变剂剂（甲甲基基磺磺酸酸乙乙酯酯，EMS）诱诱发发产产生生一一系系列列的的点点突突变变，再再用用设设计计的的特特异异性性引引物物进进行行PCR扩扩增增，然然后后将将PCR扩扩增增产产物物变变性性和和退退火火形形成成异异源源双双链链核核酸酸分分子子，再再用用特特异异切切割割错错配配的的内内切切酶酶CELl酶酶切切，最最后后变变性性处处理理后后采采用用双双色色聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝胶凝胶（PAGE）电泳检测分析。

电泳检测分析。

（建池）（建池）TILLING特点：

特点：

TILLING技术属于高频率点突变和技术属于高频率点突变和PCR筛选相结筛选相结合的技术，可发现基因的错义突变、基因截短型合的技术，可发现基因的错义突变、基因截短型损伤等突变类型。

损伤等突变类型。

u可可获获得得大大量量的的等等位位基基因因系系列列，对对长长度度很很小小基基因因，复等位基因等具有独特的技术优势。

复等位基因等具有独特的技术优势。

u可可诱诱导导产产生生高高频频率率的的点点突突变变，筛筛选选目目的的基基因因需需要要较小的突变群体。

较小的突变群体。

u不不依依赖赖于于农农杆杆菌菌介介导导转转化化或或内内源源标标签签系系统统，无无需需耗时的转基因和复杂的组织培养。

耗时的转基因和复杂的组织培养。

u需要知道所研究基因的序列。

需要知道所研究基因的序列。

2）随机插入突变）随机插入突变A.T-DNA插入突变插入突变以以农农杆杆菌菌介介导导的的转转化化为为基基础础的的一一种种插插入入突突变变研研究究方方法法，根根据据插插入入位位点点的的基基因因序序列列与与植植物物表表型型变变异异等等的的相相互互关关系系可可以以从从基基因因组组中中分分离离出出相相应应的的基基因因并并鉴定其功能。

鉴定其功能。

构建构建T-DNA载体载体转化转化突变体的筛选及遗传分突变体的筛选及遗传分析析分离分离T-DNA插入位点的侧翼序列插入位点的侧翼序列基因的基因的定位、结构与功能分析。

定位、结构与功能分析。

T-DNA法法敲敲除除植植物物基基因因及突变体筛选：

及突变体筛选：

a.引引物物设设计计。

LP和和RP分分别别代代表表插插入入基基因因两两端端的的引引物物，LB是是指指载载体体上上的的一一段段引引物物。

旁旁邻邻序序列列是是经经测测序序后后获获得得的的DNA序列。

序列。

b.PC