植物DNA和RNA提取方法.docx
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植物DNA和RNA提取方法
植物DNA和RNA提取方法
实验一植物基因组DNA的提取
一、实验目的
掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。
学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
二、实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类）对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠（sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadyltrimethylammomumbromide，简称为CTAB）、十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，简称SDS）等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
三、实验材料
水稻幼叶
四、主要试剂配方
2%CTAB抽提缓冲溶液:
CTAB4gNaCl16.364g1MTris-HCl20ml（PH8.0）0.5M
EDTA8ml，先用70mlddH2O溶解,再定容至200ml灭菌,冷却后0.2-1%2-巯基乙醇
（400ul）
氯仿-异戊醇（24：
1）：
先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。
五、实验步骤
1.DNA的提取
（1）2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。
（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；
（3）加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；
（4）将磨碎液分倒入1.5ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；
（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10min轻轻摇动，40min后取出；
（6）冷却2min后，加入氯仿-异戊醇（24：
1）至满管，剧烈振荡2~3min，使两者混合均匀；
（7）放入离心机中10000rpm离心10min，与此同时，将600µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；
（8）10000rpm离心1min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；
（9）10000rpm离心1min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；
（10）60sec后，直立离心管，加入720µl的75%乙醇及80µl5M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；
（11）放置30min，使DNA块状物的不纯物溶解；
（12）10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800µl75%的乙醇，将DNA再洗30min；
（13）10000rpm离心30sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；
（14）加入50µl0.5×TE（含RNase）缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15h，使RNA消解；
（15）置于-20℃保存、备用。
2.DNA质量检测
琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。
六、注意事项
（1）叶片磨得越细越好。
（2）移液器的使用。
（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。
思考题：
1.本实验中所用到的各试剂的作用是什么?
CTAB,氯仿,异丙醇,75%乙醇,EDTA
2．提取基因组DNA的方法有哪些？
各有何优缺点？
实验二多聚酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
一、实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。
二、实验原理
PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。
基本原理及过程如下：
PCR循环过程中有三种不同的事件发生：
（1）模板变性；
（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1．变性：
加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2．退火：
在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。
3．延伸：
体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：
DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNATaq聚合酶。
琼脂糖凝胶电泳的原理：
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。
不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。
EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。
用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。
三、实验材料及相关试剂
基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等
四、实验步骤
1．模板DNA的抽提：
实验一所得的水稻基因组DNA。
2．PCR操作（在冰上操作）：
（1）PCR反应混合液的配制：
反应体系25µL,在无菌的0.2mL离心管中按下列操作程序加样：
反应物
加样顺序
体积/µL
终浓度
ddH2O
1
17.3×n
10xBuffer
2
2.5×n
1x
25mmol/LMgCl2
3
1.5×n
1.5mmol/L
10mmol/LdNTP
4
0.5×n
200µmol/L
10µM上游引物
5
1×n
0.4µmol/L
10µM下游引物
6
1×n
0.4µmol/L
DNATaq聚合酶
7
0.2×n
1U
（2）将反应混合液混匀,然后每个PCR管中分装24µL反应混合液，再加1µL模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发,然后稍离心。
（3）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：
94℃4min（预变性）94℃30sec,60℃30sec,72℃2min72℃7min
35个循环
（4）注意事项
由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。
a.所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。
b.操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。
c.每加一种反应物，应换新的枪头。
3．PCR产物的检测：
琼脂糖浓度（1.2%）；EB浓度（5µl/100mlTBE）
（1）制胶（以150mL为例）
a.称取1.8g琼脂糖，加入150ml的TBE缓冲液（pH8.0），摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。
b.电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量;
c.用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃），倒入其中，直至厚度为4～6mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固（约30~45min）；
d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。
（2）点样
a.将2.0µl溴酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心；
b.每孔点样10.0µl，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。
（3）电泳
打开电源开关，调节电压至3~5V/cm（约100V），可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。
（4）染色
将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中,染色15-20分钟。
（5）观察
将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。
如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。
（6）注意事项
a.煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。
b.煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。
c.倒胶注意厚度（4-6mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。
也可待胶稍凝固后，放入4℃冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。
d.加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。
e.一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。
凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。
思考题：
1．PCR反应液中主要成分是哪些？
在PCR反应过程中各起什么作用？
2．为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？
3．用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？
实验三植物总RNA的提取
一、实验目的
通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法
二、实验原理
RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。
高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。
细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
三、仪器、药品与试剂配方
（一）仪器
1．低温离心机
2．分光光度计
3．琼脂糖胶电泳系统，用前先用1%NaOH溶液浸泡过夜,之后再用DEPC水浸泡冲洗。
4．高压灭菌锅
5．研钵、剪刀、一次性手套等
（二）药品
1.焦碳酸二乙酯（DEPC）
2.吗啉代丙烷磺酸（MOPS）
3.异硫氰酸胍
4.醋酸钠（NaAc）
5.氯仿
6.苯酚
7.甲醛
8.乙醇
9.乙二胺四乙酸（EDTA）
10.琼脂糖
11.异丙醇
（三）试剂配方
1．0.1%DEPC水
1.1mlDEPC加入100ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。
2.2mol/LNaAc、0.5mol/LEDTA、4mol/L异硫氰酸胍、4mol/LLiCl等均用DEPC水配制。
3.5ΧMOPS电泳缓冲液（pH7.0）
MOPS0.1mol/L
NaA
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