植物DNA和RNA提取方法.docx

1、植物DNA和RNA提取方法植物DNA和RNA提取方法实验一 植物基因组DNA的提取一、实验目的掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、

2、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。三、实验材料水稻幼叶四、主要试剂配方2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶

3、解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。五、实验步骤1. DNA的提取（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65水浴中预热。（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；（4） 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；（5）置于65的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡23 min，使两者混合均匀；

4、（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 l的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；（8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；（10）60 sec后，直立离心管，加入720 l的75%乙醇及80 l 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物

5、溶解；（12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 l 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；（14）加入50 l 0.5 TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37恒温箱约15 h，使RNA消解；（15）置于-20保存、备用。2. DNA质量检测 琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。六、 注意事项 （1）叶片磨得越细越好。 （2）移液器的使用。 （3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA

6、抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。思考题：1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么? CTAB, 氯仿, 异丙醇, 75%乙醇, EDTA2提取基因组DNA的方法有哪些？各有何优缺点？实验二 多聚酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测一、 实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。二、 实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：PCR循环过程

7、中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。1 变性：加热使模板DNA在高温下（94-95）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2 退火：在体系温度降至37-65，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。3 延伸：体系反应温度升至中温72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5到3方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，

8、样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是

9、利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。三、实验材料及相关试剂 基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等四、实验步骤1模板DNA的抽提：实验一所得的水稻基因组DNA。2PCR操作 (在冰上操作)： （1）PCR反应混合液的配制：反应体系25 L, 在无菌的0.2 mL离心管中按下列操作程序加样： 反应物加样顺序体积/L终浓度ddH2O117.3n1

10、0 x Buffer 22.5n1 x25 mmol/L MgCl231.5n1.5 mmol/L10 mmol/L dNTP40.5n200 mol/L10 M上游引物51n0.4 mol/L10 M下游引物61n0.4 mol/L DNA Taq聚合酶70.2n1 U（2）将反应混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24 L反应混合液，再加1 L模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发, 然后稍离心。（3）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：94 4 min (预变性) 94 30 sec, 60 30 sec, 72 2 min 72 7 min 35个循环（4）注意事项

11、由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。a. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。b. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。c. 每加一种反应物，应换新的枪头。3PCR产物的检测： 琼脂糖浓度（1.2%）；EB浓度（5 l / 100 ml TBE）（1）制胶（以150 mL为例） a. 称取1.8 g 琼脂糖，加入150 ml 的TBE缓冲液（pH 8.0），摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。 b. 电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量; c. 用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂

12、糖（约50），倒入其中，直至厚度为46 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30 45 min)； d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。 （2）点样 a. 将2.0 l 溴酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心； b. 每孔点样10.0 l，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。（3）电泳 打开电源开关，调节电压至35 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。（4）染色 将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中, 染色15-20分钟。（5）观察将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带

13、，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。（6）注意事项a. 煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。 b. 煮好的胶应冷却至50左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。c. 倒胶注意厚度（4-6 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。d. 加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。e. 一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。凝胶中含有

14、EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。思考题：1 PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？2 为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？3 用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？实验三 植物总RNA的提取一、实验目的 通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法二、实验原理 RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA

15、，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。三、仪器、药品与试剂配方(一) 仪器1 低温离心机2 分光光度计3 琼脂糖胶电泳系统，用前先用1% Na OH溶液浸泡过夜,之后再用DEPC水浸泡冲洗。4 高压灭菌锅5 研钵、剪刀、一次性手套等(二) 药品1. 焦碳酸二乙酯(DEPC)2. 吗啉代丙烷磺酸(MOPS)3. 异硫氰酸胍4. 醋酸钠(NaAc)5. 氯仿6. 苯酚7. 甲醛8. 乙醇9. 乙二胺四乙酸(EDTA)10. 琼脂糖11. 异丙醇(三) 试剂配方1 0.1% DEPC水1.1 ml DEPC 加入100 ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。2. 2 mol/L NaAc、0.5 mol/L EDTA、4 mol/L异硫氰酸胍、4 mol/L LiCl等均用DEPC水 配制。3. 5MOPS 电泳缓冲液(pH 7.0)MOPS 0.1 mol/LNaA