马铃薯快速繁殖实验结果.docx
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马铃薯快速繁殖实验结果
一．实验设计方案
实验序号
实验名称
实验时间
实验室
（一）实验目的
1、通过本次实验，进一步熟悉无菌操作技术；
2、熟悉马铃薯快繁培养基及试管薯诱导培养基的配置方法；
3、掌握配制培养基的步骤，能熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方；
4、了解马铃薯脱毒种薯生产的过程，为马铃薯脱毒种薯的生产提供必要的基础苗。
5、通过本次实验，使学生能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩固相关理论基础知识。
（二）实验原理、实验流程或装置示意图
1、实验原理
马铃薯是高度杂合的，因此它们的种子后代不可能与原种完全相同。
只有由无性繁殖产生的植株，在遗传上才能与其亲本植物完全相同，从而可使品种的特性代代相传；
短枝发生型是指外植体携带的带叶茎段，在适宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。
该方法与田间枝条的扦插繁殖方法类似，故又称为微型扦插。
能一次成苗，遗传性状稳定，培养过程简单，移栽成活率高。
许多花卉、葡萄、马铃薯等试管苗的繁殖常用此方法。
利用植物组织培养技术，在无菌条件下对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法称为植物离体无性繁殖。
在黑暗环境的诱导下，马铃薯试管苗可以在试管薯诱导培养基中结出种薯，且悬于茎秆上。
马铃薯试管薯是利用茎尖分生组织脱毒技术，在组织培养条件下高倍扩繁脱毒试苗，进而诱导试管苗所形成的块茎。
试管薯具有无病原、体积小、贮藏运输方便、能工厂化周年生产。
微型薯是指通过组织培养方法，在试管中生产的马铃薯块茎他的体积小、重量轻，一般只有1-5克，从而为马铃薯优良种质的保全提供了一条理想的途径。
马铃薯试管苗在光照条件下进行自养的程度大于异养。
相反，在高浓度的糖类存在的情况下，以及在无光照的限制条件下，马铃薯向着诱导生成试管薯的过程。
这样生长出来的试管薯称之为原原种种薯。
培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质。
配制培养基时，为了减少试剂称取时的工作量和少量称取时出现的误差，以及避免多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，预先要将各种营养成分配制为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到要求的浓度。
母液的浓度为培养基浓度的10倍、100倍或更高。
不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由无机营养物、碳源、
维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。
配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉溶解在蒸馏水里，加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，再加入蒸馏水使之达到最终的容积。
最后调节pH值，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。
如果没有培养基干粉，则可采用以下两种方法来配制：
一个是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起。
另一个是先配制一系列的浓缩贮备液（母液），贮存在2～4℃冰箱内，待配培养基时取出，按比例稀释配用。
此法较为常用。
母液的配制有两种方法：
①、配制成单一化合物母液。
此法适合配制多种培养基都需要的同一种母液。
②、配成几种不同化合物的混合母液。
此法在大量配制同种培养基时省时省力。
由于MS培养基较为常用，故配制MS培养基母液。
配好的母液应放在试剂瓶中贮存。
本实验采用后者配制母液。
将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。
培养基配方设计：
（1）根据培养的目的选择一种培养基为基本培养基。
（2）确定培养基中各种激素的浓度及相对比例。
本实验中马铃薯试管苗快速繁殖培养基为MS培养基。
诱导培养基的配方如下：
MS培养基+5mg/L6-BA+8%蔗糖。
2、实验流程
（1）实验总体流程
（2）母液配制流程
（3）马铃薯试管苗快速繁殖培养基的配制流程
（三）实验设备及材料
1、实验设备
果酱瓶、500mL搪瓷杯、三角瓶、烧杯、容量瓶、玻璃棒、25mL量筒、1mL和5mL移液管、洗耳球、PH试纸、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、普通电子天平、酒精棉球、小块纱布、灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、超净工作台、冰箱、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉、记号笔。
2、药品和试剂
（1）母液配制：
硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、NAA（α-萘乙酸）、6-BA（6-苄基腺嘌呤）、浓盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水等。
（2）马铃薯快速繁殖培养基及诱导培养基的配制：
事先配好的MS基本培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH等。
（3）其他：
75%酒精等。
3、实验材料
马铃薯脱毒苗
（四）实验方法步骤
1、MS培养基母液和常用试剂的配制
（1）大量元素母液的配制
▪MS培养基中的9种大量元素除C、H、O外，剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、CaCl2•2H20、MgSO4•7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应，它们可配在同一母液中（具体配制见下表）。
配制的步骤为：
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。
▪注意：
CaCl2•2H20最后加入
母液
种类
成分
规定用量
/mg•L-1
扩
大
倍
数
称取量/mg
母液定容体积/ml
配1LMS培养基吸取取量/ml
大量元素
KNO3
1900
20
38000
1000
50
NH4NO3
1650
33000
CaCl2•2H20
440
8800
MgSO4•7H2O
370
7400
KH2PO4
170
3400
（2）微量元素母液的配制
MS培养基中的微量元素可由MnSO4•4H2O、ZnSO4•7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4•2H2O、CuSO4•5H2O、CoCl2•6H2O几种无机盐来供应，它们也可配在同一母液中（具体配制见下表）。
配制步骤同大量元素（混合时不要求先后顺序）。
母液
种类
成分
规定用量
/mg•L-1
扩
大
倍
数
称取
量/mg
母液定容体积/ml
配1L培养基吸取量/ml
微量元素
MnSO4•H2O
16.9
200
3380
1000
5
ZnSO4•7H2O
8.6
1720
H3BO3
6.2
1240
KI
0.83
166
Na2MoO4•2H2O
0.25
50
CuSO4•5H2O
0.025
5
CoCl2•6H2O
0.025
5
（3）有机成分母液的配制
▪MS培养基中所需的维生素和氨基酸等有机成分母液应分别单独配制（具体配制见下表）。
配制的步骤为：
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→溶解→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。
▪亦可配制成混合母液（不主张采用）。
母液
种类
成分
规定用量
/mg•L-1
扩
大
倍
数
称
取
量
/mg
母液定容体积/ml
配1LMS培养基吸取量/ml
有
机
成
分
甘氨酸
2.0
200
100
250
5
盐酸硫胺素
0.1
5
盐酸吡哆素
0.5
25
烟酸
0.5
25
肌醇
100
5000
（4）铁盐母液的配制
▪铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为：
▪确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→煮沸数分钟→调节pH值至5.8→定容→装瓶（棕色）→贴标签→放入冰箱保存。
▪用时每配lL培养基取该溶液5ml。
母液
种类
成分
规定用量
/mg•L-1
扩
大
倍
数
称
取
量
/mg
母液定容体积/ml
配1LMS培养基吸取量/ml
铁盐
Na2EDTA•2H2O
37.3
200
1865
250
5
FeSO4•7H2O
27.8
1390
（5）植物生长调节物质母液的配制
▪对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg·ml-1或ppm较为方便，一般配制成0.1-1mg·ml-1的母液，这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶。
▪2,4-D/NAA用少量95％酒精溶解，再加水定容；6-BA应先溶于少量1mol·L-1的HCl中，再加水定容。
▪具体配制见下表：
母液
种类
成分
称取量
（mg）
母液定容体积（ml）
母液浓度（mg/ml）
生长调节物质
2,4-D/NAA
50
100
0.5
6-苄氨基嘌呤
10
0.1
（6）其它常用试剂的配制
▪盐酸（lmol·L-1）：
用浓度36.5%、密度1.19g/cm3的浓盐酸配制。
本次试验用8.4ml配制。
▪氢氧化钠（lmol·L-1）：
用固体氢氧化钠配制。
本次试验用4g配制。
▪75%酒精（v/v）：
用95%的酒精来配制
（7）配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、配制者、配制日期。
（8）母液最好在2～4℃的冰箱中保存。
尤其对生长调节物质与有机类物质要求较严。
▪贮存时间不宜过长，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用。
2、马铃薯试管苗快速繁殖培养基的配制
▪基本配方：
MS基本培养基＋0.7％琼脂＋3％蔗糖
每小组配制0.5L
▪
（1）药品及用具的准备
▪配制培养基时先将事先配制贮存的母液按顺序放好，并检查这些母液是否已变色或产生沉淀或产生结晶，已失效的就不要取用。
MS培养基母液包括大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机物母液。
▪将洁净的各种用具如三角瓶、果酱瓶、量筒、烧杯、吸管、玻璃棒、精密pH试纸、封口膜、橡皮筋、电炉等准备好放在指定的位置。
再将蒸馏水、琼脂、蔗糖、生长调节物质、1mol·L-1NaOH、1mol·L-1HCl准备好。
▪
（2）琼脂溶解
▪根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂（0.７～0.８％），撕碎后放入搪瓷杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电磁炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。
（3）加母液和蔗糖及定容
待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放于一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需要的生长调节物质，最后加蒸馏水至所需体积。
（4）调PH
▪由于培养基的pH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响。
此外，琼脂培养基的pH值还影响到凝固情况。
所以，当培养基配制好后应立即进行pH值的调整。
最好用酸度计测试，既快又准，如无条件也可用精密pH试纸。
培养基若偏酸时用lmol·L-1NaOH来调节，偏碱则可用lmol·L-1HCl来调节。
一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；pH值低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。
（5）培养基的分装
配制好的培养基要趁热分装，本实验用果酱瓶直接加注。
每瓶20～30ml，太多既浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；太少又会因营养不良影响生长。
培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用细棉线扎紧。
（6）培养基的灭菌
培养基分装后应立即置于高压蒸气灭菌锅内进行灭菌。
消毒灭菌时，压力表读数约为1.06kgf·cm-2或0.105MPa（可在0.105～0.12MPa间，但不得超过0.14MPa），温度121℃时保持15～30min左右即可。
3、马铃薯试管苗的接种和快速繁殖
（1）接种工具的灭菌
分别取枪状镊子2把、眼科手术剪和手术刀各1把，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；每套培养皿内放入合适滤纸2～3张，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；然后和培养基一起统一灭菌。
（2）接种
①、在无菌条件下，将由茎尖培养得到的脱毒马铃薯从试管中取出来，放在无菌培养皿中。
②、将植株切成单节茎段，每段只带1-2个叶片和腋芽。
将茎段植入装有繁殖培养基的果酱瓶中。
每瓶接种5个茎段。
接种时注意倾斜瓶口45度左右，最后封好瓶口。
（3）培养
将果酱瓶置于培养室中培养，培养条件是室温25-27℃。
每天光照16小时。
光强2000-3000lx。
（4）观察
2-3周之后每个茎段上都已生根长芽，随后苗逐渐长高，叶片数目增加。
为下一步微型薯诱导提供足够材料。
与此同时，培养基也越来越少。
4、马铃薯试管薯诱导培养基的配制及试管薯的诱导
（1）诱导培养基的配制
配方如下：
MS培养基+5mg/L6-BA+8%蔗糖。
按以上配方配好后，用正确的步骤依次进行PH调节、培养基分装、灭菌等步骤，最后做好标记，保存。
（2）微型薯的诱导
①、在无菌条件下，在超净工作台内严格按无菌操作步骤要求，打开马铃薯培养基，将液体微型薯诱导培养基倒入果酱瓶中，封口。
②、更换培养基后，将果酱瓶放在室温25-27℃完全黑暗的条件下静止培养，不需要摇动或者摆动。
5、记录实验结果
（1）在实验过程中注意无菌操作的要点。
（2）扦插的无菌马铃薯苗要适当的深度，不要过深也不要过浅。
（3）在单节茎段繁殖过程采用的是光照培养，在微型薯的诱导是在黑暗条件下培养的。
（4）接种时注意倾斜瓶口，以免带入病菌，引起污染。
（5）接种时切勿倒插马铃薯的单节茎，若不小心倒插，单节茎短期内虽不会死亡，但因违背了植物的生理性极性，因此不会生根。
（6）5.1在马铃薯脱毒试管苗的快速繁殖，在选取枝条时必须注意每个枝条要留一个芽，这样才能正常进行生长；
5.2在进行实验前也要进行认真的消毒；
5.3从果酱瓶上去下的封口膜要正确的放置；
5.4封口时也要靠近酒精灯，不要离开无菌操作台，放置被污染；
5.5单节茎插在培养基中应保证固定；
5.6每瓶单节茎的数目与控制一定的数目约10-20个不要过多或过少。
配制培养基时先将事先配制贮存的母液按顺序放好，并检查这些母液是否已变色或产生沉淀或产生结晶，已失效的就不要取用。
▪为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。
排净冷空气的办法有两种：
▪
（1）可以事前打开灭菌锅放气阀，煮沸，待大量热蒸气排出后再关闭；
▪
（2）也可采用先关闭放气阀，待压力升到约0.04MPa，温度超过108℃时打开放气阀排出空气，待压力表指针回到0时再关闭放气阀。
培养基灭菌注意的问题：
▪
（1）灭菌前检查锅内是否有足够的水；
▪
（2）装锅不可过满；
▪（3）培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。
（4）当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。
切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员。
▪在配制MS培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。
▪混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42-和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物。
同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。
▪母液最好在2～4℃的冰箱中保存。
尤其对生长调节物质与有机类物质要求较严。
▪贮存时间不宜过长，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用。
▪
（1）玻璃器皿的洗涤
▪
（2）天平的使用
▪（3）配制大量元素时溶液的混合
▪（4）铁盐的配制
▪（5）洗液的配制
原理：
（2）确定培养基中各种激素的浓度及相对比例。
本实验中马铃薯试管苗快速繁殖培养基为MS培养基。
诱导培养基的配方如下：
MS培养基+5mg/L6-BA+8%蔗糖。
采用固液培养法诱导。
结薯率=总结薯个数/植株总数×100%
单薯的重量=总重量/总薯数*100%
步骤（3）培养
将果酱瓶置于培养室中培养，培养条件是室温25-27℃。
每天光照16小时。
光强2000-3000lx。
②、更换培养基后，将果酱瓶放在室温25-27℃完全黑暗的条件下静止培养，不需要摇动或者摆动。
（五）注意事项
由于高温高压灭菌会对部分物质活性产生一定的影响，因此配制培养基时要予以注意。
如NAA要最后加。
（一）实验现象及观察结果
1、马铃薯试管苗快繁结果：
下图为马铃薯试管苗快繁结果：
图1马铃薯试管苗快繁结果
由图可见：
经培养，瓶内15株（每瓶5棵，共3瓶）均成活，长势良好，株高和茎粗正常，叶片深绿色偏小；未出现茎段陡长的现象。
但由于培养时间较长，果酱瓶内培养基明显减少。
2、马铃薯试管薯诱导结果：
由于时间关系，本小组实验绝大部分培育的苗尚未开始结薯，有极个别瓶苗结1-2个。
因此，不方便计算结薯率和单薯的重量。
（二）实验分析讨论
1、光照对苗的快繁影响较大。
中期观察发现，苗未直立生长，且整体向一个方向倾斜，有较明显的向光生长趋势。
后期对培养瓶移位，改变捕光方向和位置后，有明显改善。
这是由于培养架内各处光照不均匀，以至偏向角落的苗向光生长。
2、马铃薯试管苗快繁过程中发现，有些同学的苗始终不长高，且不生根。
这是由于扦插时，违背了其形态学特性，故不生根。
3、避光才能诱导微型薯的产生。
在培育过程中，不时会有同学打开挡光布，甚至直接将培养瓶拿出来观察，这对试管薯的诱导是及其不利的。
4、有些同学快繁培养基耗尽后未及时更换或补充新的培养基，以致快繁苗因营养缺乏而死。
（三）实验总结
本次实验包括以下主要环节：
培养基的配制、试管苗快繁培养以及马铃薯试管薯诱导。
在配制培养基过程中，各小组分工合作，操作谨慎。
本小组负责的是NaOH和HCl溶液的配制，小组内分工明确，各行其职。
但在本次实验过程中，由于缺水等各种原因，导致部分同学操作上的马虎，把自来水误当做蒸馏水，用于配制母液。
不过，还好这只是少数情况，由于时间关系，本小组并未重新配制母液，部分母液与其他组共用，部分就将就着使用。
通过后面的实验观察和实验结果可知，基本没有较大的问题。
但这次只是因为发现及时，挽救措施得当，才不至于引起实验失败。
在今后的实验过程中，应尽量避免这类错误的发生，以免对后续的整个过程都造成影响，甚至导致全军覆没。
关于快繁苗，我小组实验结果较好。
但有些小组同学因为快繁培养基耗尽后未及时更换或补充新的培养基，以致快繁苗因营养缺乏而死。
因此，控制好苗的营养所需是相当重要的。
由于时间关系，试管薯诱导尚未完成，期待期末后会出现满意的结果。
但在次期间，适当的管理如避光等措施仍然是不容忽视的。
这次实验在全组同学的共同努力下，实验取得了相对满意的结果，基本得到了预期结果。
当然，这也离不开老师的悉心教导和在培育期间对苗的细心照料，如光照和温度等方面的严格控制。
总之，这次实验的成功是老师和同学们共同努力的结果。
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