分子生物学实验报告正文.docx

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分子生物学实验报告正文

Abstract：

Bioengineeringclass134inLifeScienceCollegestudiedthemolecularbiologyexperimentunderthetheacherJunfengPan’sguidence.Thewholeexperimentaroundthe“southernhybridizationofdigoxinmark”asthecenter,includingexperimentswithhighstandards（suchasamplicationcDNAofRT-PCRandSouthernhybridization）andfundamentalexperiments.Fundamentalexperimentsincludetheplasmid’sDNAextraction,agarosegelelectrophoresis,polymerasechainreaction,plantRNAextractionandelectrophoresis,wheatgenomesDNAextraction,enzymedigestion,electrophoresisanalysis,preparationandtransferma-

tionofcells.Mostexperimentswentwell,butthequalityofextractedDNAandRNAwasnotverygood.Additionally,theresultofelectrophoresisanalysisofRT-PCR’sproductjustshowedprimer,nottargetgene.Afteranalysis,wethinkthereasonoffailingmaybematerial,itwasfreezedtoolong.

Keywords:

southernblot;molecularbiologyexperiment;

extractionofnucleicacid;PCR;electrophoresis

1.前言：

（略）

2.实验：

2.1实验材料

暗培养7天的小麦幼苗（黄化苗），含质粒的大肠杆菌P38

2.2试剂

2.2.1质粒DNA提取

质粒小提试剂盒（天根公司，中国产）

LB液体培养基：

胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.0。

高压灭菌20分钟。

LB平板培养基：

在每1000mLLB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20分钟。

溶液Ⅰ：

50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/LTris-Hcl（pH8.0）,冰箱保存，RNA酶要提前加入溶液Ⅰ中；

溶液Ⅱ：

0.2mol/LNaOH,1%SDS（碱性的NaOH使蛋白质变性，SDS结合变性的蛋白质）；

溶液Ⅲ：

Ph4.8的醋酸钾溶液（5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml,水28.5ml）；

TE缓冲液（pH8.0）：

10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTAl；

无水乙醇和70%乙醇。

2.2.2质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定

EcoRⅠ酶（Thermo,美国）λDNA

TBE缓冲液（5×）：

用时需稀释10倍

点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：

0.25%溴酚蓝，40%甘油

溴乙啶（EB）：

10mg/ml溴乙啶（注意：

该试剂具致癌作用，用时要小心）琼脂糖1%

2.2.3质粒载体和外源DNA的连接反应

目标DNA片段（P38质粒的PCR扩增产物）

载体（pGEM-TEasy）

2×ligation缓冲液

T4DNA连接酶

2.2.4感受态细胞的制备及转化

0.1mol/LCaCl2取20μlPCR产物进行1.2%琼脂糖电泳分析。

LB液体培养基

LB固体培养基

氨苄青霉素（100mg/mL）

2.2.5地高辛标记的Southern杂交

1.DIGRandomLabelingMix（高效）（博士德，中国）

2.Anti-DIG-APConjugate

3.BCIP/NBTStockSolution

4.BlockingReagent

5.20×SSC：

0.3M柠檬酸钠，3MNaCl

6.2×SSC：

0.03M柠檬酸钠，0.3MNaCl

7.0.2MEDTA

8.变性液：

0.5NNaOH，1.5MNaCl

9.中和度：

0.5MTris-HCl，pH7.4，3MNaCl

10.Standardbuffer：

5×SSC，0.1%（w/v）N-Lauroylsarcosine,0.02%（w/v）SDS,1%BlockingReagent。

11.Standardbuffer+50%formamide

12.Anti-DIG-AP碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体

13.BCIP/NBT储备液：

14.冲洗液：

0.1MTris-HCl，0.15MNaCl.pH=7.5.

15.封闭液：

1%BlockingReagent/0.1MTris-HCl，0.15MNaCl.

16.显色缓冲液：

0.1mMTris-HCl，0.1MNaCl，pH=9.5.

17.TE缓冲液：

10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0

2.2.6RNA分离与纯化

TrizolReagent（Trizol试剂盒）

氯仿，异丙醇，70%乙醇，DEPC（含有RNA灭活酶）处理的ddH2O，溴乙锭（EB）10mg/ml，点样缓冲液Loadingbuffer（10×）（0.25%溴酚蓝，40%甘油）。

2.2.7RT-PCR扩增目的基因cDNA

RNA模板，cDNA引物，反转录缓冲液，dNTP，MMLV反转录酶（Thermo,美国），RNA抑制剂（RNasin），Taq酶及PCR缓冲液（10×），引物（P1、P2）。

2.2.8小麦基因组DNA提取、酶切及电泳分析

DNA抽提液（CT-AB）

用时将下述三种溶液按1:

1:

0.4（V/V）比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/L），即为抽提液。

①DNAextraction（500ml）：

31.885gsorbitol（山梨醇）

6.05gTrispH8.2（一般不调）

②Nucleilysisbuffer（500ml）:

100ml1MTrispH7.5

100ml0.25MEDTA

200ml5MNaCl

10gCTAB

100mlddH2O

③5OOml5%sarkosyl（N-月桂酰肌氨基钠盐）

氯仿：

异戊醇（24：

1）70%乙醇异丙醇HindIII酶EcoRⅠ酶

2.3实验器材

2.3.1质粒DNA提取

Eppendorf管，离心管，10,100.1000微量加样器，台式高速离心机（EppendorfCentrifuge5424R），摇床、高温灭菌锅。

2.3.2质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定

电泳仪系统，紫外灯，恒温水浴箱

2.3.3质粒载体和外源DNA的连接反应

低温离心机（EppendorfCentrifuge5424R），恒温移液器，恒温水浴锅

2.3.4感受态细胞的制备及转化

低温离心机（EppendorfCentrifuge5424R），平衡天平（UX620H,UniBloc），无菌操作台，微量移液器

2.2.5地高辛标记的Southern

杂交台式低温离心机（EppendorfCentrifuge5424R），恒温水浴锅，杂交管，玻璃板，砖头，大型皿，电泳系统，硝酸纤维素膜，分子杂交仪（1339，北京宾达英创科技有限公司）

2.3.6RNA分离与纯化

微量加样器，离心管（1.5ml），低温离心机（EppendorfCentrifuge5424R）

2.3.7RT-PCR扩增目的基因cDNA

PCR扩增（Appliedbiosystemsbylifetechnologies,ABI,美国），电泳仪，低温离心机（EppendorfCentrifuge5424R），恒温水浴锅

2.3.8小麦基因组DNA提取、酶切及电泳分析

PCR扩增（Appliedbiosystemsbylifetechnologies,ABI,美国）低温离心机（EppendorfCentrifuge5424R），恒温水浴锅，紫外分析仪，微量加样器

2.4实验步骤（略）

2.5实验结果

12345678910111213141516171819202122

图1P38质粒电泳结果

注：

泳道2为质粒提取结果，泳道22为Marker.

图2质粒PCR电泳结果

123456789101112131415161718

注：

泳道11为质粒PCR产物，泳道15为Marker.泳道16为空白（被Marker污染）。

图3质粒P38和EcoR酶切产物对比电泳

1234567891011121314

注：

泳道1为Marker,泳道12为P38质粒，泳道14为酶切产物。

图4菌落PCR

123456789101112131415

2000

500

800

1200

3000

4500

注：

菌落PCR结果条带略小于500.

图5植物RNA提取结果

注：

图中均为小麦RNA

图6小麦RT-PCR电泳结果

注：

均无cDNA扩增产物的条带

图7小麦基因组PCR产物电泳结果

1200

2000

3000

4500

注：

条带在500至800之间，扩增成功。

图8小麦基因组和EcoR酶切对比电泳结果

123456789101112131415161718192021222324

注：

依次从左至右，泳道数奇数为酶切结果，偶数为g-DNA.

图9southern杂交结果

注：

泳道1为P38质粒，泳道2为PCR产物，泳道3为酶切产物。

2.6分析讨论

在感受态细胞转化实验中，结果只出现了极少极少数的蓝斑，可能存在一些假阳性的结果。

原因可能是X-Gal和IPTG量比较少，又是直接混入培养基中的，大部分不能发挥作用。

X-Gal是β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。

IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。

如果将X-Gal和IPTG均匀涂抹于培养基表面，或许效果会明显一些。

图1显示，提取的质粒电泳条带结果表明其分子量大于2000，条带较为清晰。

图2显示，质粒PCR产物分子量在500至750之间。

图3中，泳道6号和7号组切割不完全或有的没有切开。

正确的酶切产物应该只有一条带，且带的位置和质粒条带几乎在同一直线上。

图4显示，菌落PCR的条带分子量在500至800之间。

图5（变性后又常温复性后补照的）显示，提取出来的RNA质量不好，没有明显的18S和28S条带，呈弥散状，降解严重，下图（第一次高压快速跑出的条带