土壤重金属对植物土壤微生物及土壤酶活性影响的研究.docx
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土壤重金属对植物土壤微生物及土壤酶活性影响的研究
土壤重金属对植物、土壤微生物及土壤酶活性影响的研究
一、课题背景及目的
在当代，人类对资源开发利用包括矿业开采等生产活动不断扩大，其作为一种经济增长的一种重要手段，也引起了一系列经济、社会、环境等问题，不利于可持续发展战略。
人类活动及随后产生的废气物随意排放，不仅破坏和占用了大量土地资源，同时也带来了一系列的环境问题如空气、地表水、地下水及土壤的质量下降，生态系统和景观受破坏，生物多样性丧失，农作物减产等。
这不仅制约了国民经济的发展、加剧了人与自然的矛盾、破坏了人们的身心健康，同时也不利于我国可持续发展战略的实施。
本研究目的了解土壤重金属对植物、土壤微生物及土壤酶活性的影响原理；掌握分析土壤理化性质、酶学性质、微生物量的能力。
二、本课题研究的技术
三、具体实验步骤
1.具体实验操作
1.1从农田中取一定重量（>50kg）的土壤，可选中一定区域，均匀设置取样点，取土深度保持一致，记录取样地点，时间等；
1.2风干后用2mm孔径的筛子进行过筛；
1.3对剩余土壤进行称重（此时剩余土壤总重量≥50kg）；
1.4取土壤50kg将土壤平均分成5组；
1.5除对照组外，其余4组，分别与不同浓度梯度的CuSO4溶液混匀（Cu2+浓度梯度为0mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg），再将混匀后的土壤平均分成5份；
1.6将这25份土壤装盆，在室内放置一周，并保持湿润；
1.7播种，每个盆中均匀种入油菜种子约30颗；
1.8植物生长过程中，保持各组生长条件一致，一定时间进行浇水，等到盆中油菜长出第二片真叶，进行定植，每盆中保留5-8株植物；在这期间，定期对植物株高、叶片大小进行测量，记下数据；
1.9植物生长一个半月后对植物以及土壤中的微生物和酶活性进行测定。
2.样本室内分析
2.1.土壤中酶活性的测定
实验中土壤酶的测定方法如下
2.1.1土壤转化酶活性的测定-比色法
2.1.1.1试剂配制
（1）3，5－二硝基水杨酸溶液：
称0.5g二硝基水杨酸，溶于20mL2N氢氧化钠和50mL水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过7天）。
（2）pH5.5磷酸缓冲液：
1/15M磷酸氢二钠（23.876g磷酸氢二钠.12H2O溶于1L蒸馏水中）0.5mL加1/15M磷酸二氢钾（9.078g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中）9.5mL即成。
（3）8％蔗糖溶液：
80g蔗糖溶于1000mL水中
（4）甲苯
（5）标准葡萄糖溶液：
将葡萄糖预先在80℃烘至恒重。
然后取500mg溶于100mL蒸馏水中，即成标准葡萄糖溶液（5mg还原糖/mL）。
再将次液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0.5mg/mL）。
2.1.1.2操作步骤
称取5g过1mm筛的风干土，置于50mL三角瓶中，注入15mL8％蔗糖溶液，5mLpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。
摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
到时取出，迅速过滤。
从中吸取滤液1mL，注入50mL容量瓶中，加3mL3，5－二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。
溶液因生成3－氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。
每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。
在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
2.1.1.3结果计算
以24h后1g土壤中葡萄糖的质量（mg）表示蔗糖酶活性（Suc）：
Suc＝a·V·n/m
式中：
a为由标准曲线求得的葡萄糖浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。
2.1.2土壤过氧化氢酶活性的测定—KMnO4滴定法
称取5g新鲜土壤于100ml三角瓶中。
加甲苯0.5ml，摇匀，于0—4℃冰箱放置半小时。
取出。
立刻加入25ml冰箱储存的含3%H2O2的水溶液。
充分摇匀后，再放置0-4℃冰箱半小时。
取出立即加入2NH2SO425ml，摇匀，过滤。
取1ml滤液，加1NH2SO44ml，用0.1NKMnO4滴定。
按此操作，用不加土壤的基质作对照测定，并根据对照和试样0.1NKMnO4的滴定，求出相当分解的H2O2的量的0.1NKMnO4消耗值。
2.1.3土壤脲酶活性测定—苯酚-次氯酸钠比色法
2.1.3.1试剂配制：
（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：
取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：
称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：
用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：
10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：
精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2.1.3.2操作步骤
称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液（ｐＨ6.7）,仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度（甲苯应浮在刻度以上）,摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：
称取0.4717g硫酸铵溶于水中，稀释至1L，则得1ml含100ug氮的标准溶液，绘制标准曲线时再稀释10倍使用。
分别吸取0-10ml经稀释的标准溶液于50ml的容量瓶中，用蒸馏水加至10ml。
然后加入4ml苯酚钠溶液，立即加入3ml次氯酸钠溶液，充分摇匀，放置20min。
显色后稀释至刻度，用1cm液槽，在比色计上于578nm处测定颜色深度。
以光密度值，对浓度绘制成标准曲线。
2.1.3.3结果计算
以24小时后1g土壤中NH3－N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）
Ure＝a·V·n/m
式中：
a为由标准曲线求得的NH3－N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。
2.2土壤中微生物量和呼吸作用的测定
2.2.1微生物量C—熏蒸-浸提法
将经去除细根、杂质的新鲜土样，放入28℃恒温培养箱中预培养7天后。
称取25g（精确至0.0001）尾矿于培养皿中，将培养皿和盛有50ml氯仿和50ml1MNaOH的烧杯同时置入干燥器，用真空泵抽至氯仿沸腾并保持2min，后密封置于28℃恒温培养箱中熏蒸24h，熏蒸结束后，取出氯仿和NaOH，用真空泵反复抽气直至土壤无氯仿味后。
取出培养皿将土壤转入250ml三角瓶中，加入100ml0.5mol·L-1K2SO4在振荡器中振荡0.5h，转速180rpm。
取出迅速用无灰分滤纸过滤，滤液用于微生物量C、N的测定；同时做未熏蒸处理，取25g（精确至0.0001）相同土壤，直接加入100ml0.5mol·L-1K2SO4在振荡器中振荡0.5h，转速180rpm。
取出迅速用无灰分滤纸过滤，滤液待测。
微生物量C的测定方法：
取8ml上述滤液，加入0.067M的重铬酸钾2ml，加入70mg氧化汞和浓硫酸、浓磷酸混合液（V硫:
V磷=2:
1）15ml。
在170℃下回流冷凝0.5h，最后用标定的硫酸亚铁铵溶液来滴定反应液，同时做未熏蒸和蒸馏水空白对照
2.2.2呼吸作用的测定—氢氧化钠吸收法
称取约30g左右的新鲜尾矿（相当于风干土25g）放入1000ml的广口瓶中，在一离心管中加入25ml0.1mol·L-1NaOH将其吊在光口瓶塞得下方，塞紧瓶塞（注意NaOH不能与尾矿接触），并做几个无土对照。
将其一并放入37℃恒温培养箱培养培养24h，将离心管取出迅速用硼砂标定过的0.1mol·L-1HCl进行滴定。
最后用空白消耗的HCl体积与样品消耗的HCl体积差来计算土壤呼吸作用。
2.3.植物中金属含量测定
2.3.1植物金属含量测定
待测液的制备：
称取磨细烘干的植物样品1.0000g，置于150ml三角瓶中，先用少许水润湿，加入5ml酸混合液（V浓硝酸:
V浓硫酸:
V高氯酸=8:
1:
1）浓硫酸浸泡过夜。
次日在瓶口放一弯颈漏斗，在电热板上先低温缓慢加热40min后，逐渐提高温度待植物样品大部分变白后高温消煮，待高氯酸分解冒白色浓烟后2-3min分解完全，此时三角瓶中硫酸冷凝回流，冒缕状白烟，溶液呈亮清色。
取下三角瓶，冷却后用10%HCl洗涤小漏斗，将洗涤液和消煮液一并转入50ml容量瓶中。
待测。
测定用ICP进行。
四、数据处理
油菜在不同浓度的铜离子下的生长情况
油菜茎长（平均值）单位：
cm
样本编号
第一个星期
第二个星期
第三个星期
第四个星期
第五个星期
第六个星期
第七个星期
0-1
2.3
2.4
2.8
3
3.1
3.1
3.1
0-2
2.2
2.5
2.7
3.1
3.2
3.2
3.2
0-3
2.3
2.4
2.7
3.2
3.4
3.4
3.4
0-4
2.1
2.3
2.6
3
3.3
3.4
3.5
0-5
2.2
2.3
2.5
3.2
3.2
3.3
3.3
50-1
2
2.2
2.6
3.2
3.4
3.5
3.5
50-2
2.2
2.3
2.5
3.4
3.5
3.5
3.5
50-3
2.3
2.4
2.7
3.3
3.5
3.6
3.6
50-4
2.2
2.5
2.8
3.4
3.5
3.5
3.5
50-5
2.3
2.4
2.7
3.2
3.4
3.5
3.5
100-1
2.4
2.6
2.8
3.5
3.6
3.7
3.7
100-2
2.3
2.5
2.8
3.4
3.5
3.5
3.5
100-3
2.2
2.4
2.6
3.3
3.5
3.6
3.6
100-4
2.4
2.5
2.8
3.2
3.4
3.5
3.6
100-5
2.3
2.4
2.7
3.3
3.4
3.5
3.5
150-1
2.4
2.5
2.7
3.4
3.5
3.5
3.5
150-2
2.2
2.4
2.7
3.5
3.5
3.6
3.6
150-3
2.3
2.4
2.8
3.5
3.5
3.6
3.6
150-4
2.3
2.5
2.9
3.2
3.6
3.6
3.6
150-5
2.4
2.5
2.9
3.3
3.5
3.6
3.6
200-1
2.1
2.3
2.5
3.2
3.4
3.5
3.5
200-2
2.2
2.3
2.6
3.2
3.3
3.3
3.3
200-3
2
2.1
2.5
3.1
3.2
3.2
3.2
200-4
2.2
2.3
2.6
3
3.2
3.3
3.4
200-5
2.1
2.2
2.4
3
3.1
3.1
3.2
油菜叶片大小（平均值）单位：
cm的平方
样本编号
第一个星期
第二个星期
第三个星期
第四个星期
第五个星期
第六个星期
第七个星期
0—1
1.5
1.8
2.4
3.2
3.9
4
4.2
0-2
1.4
1.9
2.4
3.5
3.7
3.8
4
0-3
1.5
2
2.2
3.3
4.1
4.2
4.2
0-4
1.2
2.1
2.3
3
3.8
3.9
3.9
0-5
1.4
2.1
2.5
3.6
3.6
3.7
3.8
50-1
1.3
2
2.4
3.6
3.8
3.8
4
50-2
1.2
1.9
2.3
3.7
4.1
4.1
4.1
50-3
1.3
1.6
2.1
3.5
3.6
3.7
3.9
50-4
1.4
1.8
2.1
3.4
3.5
3.8
4.3
50-5
1.3
1.9
2.3
3.5
3.8
3.8
4.4
100-1
1.2
1.9
2.1
3.3
3.6
3.8
4.3
100-2
1.4
2.2
2.3
3.4
3.7
3.8
4.2
100-3
1.3
2.3
2.4
3.5
3.5
3.9
4.3
100-4
1.4
2.2
2.3
3.5
3.6
3.9
4.1
100-5
1.5
2
2.4
3.7
3.8
3.9
4.5
150-1
1.3
2.1
2.5
3.7
3.7
3.9
4.6
150-2
1.2
1.9
2.4
3.8
4
4.1
4.5
150-3
1.2
1.9
2.3
3
3.6
4.1
4.4
150-4
1.4
2.1
2.6
3.7
4.1
4.3
4.3
150-5
1.4
2
2.7
3.8
3.9
4.4
4.4
200-1
1.5
1.8
2.5
4
4
4.3
4.3
200-2
1.3
1.9
2.4
3.5
3.7
3.9
3.9
200-3
1.4
2
2.5
3.4
3.9
4
4.1
200-4
1.4
2.3
2.6
3.5
3.6
3.7
3.8
200-5
1.5
1.8
2.5
3.3
3.6
3.8
3.8
随着植物的增长，植物茎长增加植物叶片增大，从数据和图表中并不能明显看出植物在生长过程中受到抑制或是促进生长的作用：
在研究土壤重金属的过程中，在该铜离子浓度范围内，土壤中铜离子浓度对植物的生长没有明显的影响
土壤含水量测定
编号
坩埚重（g）
坩埚+土样（g）
烘干后（g）
0—1
13.471
30.662
26.479
0—2
15.706
31.436
27.473
0—3
17.479
37.218
31.831
0—4
15.764
38.263
32.314
0—5
11.994
30.404
25.939
50—1
11.29
35.49
27.916
50—2
17.135
39.405
32.544
50—3
12.671
40.227
31.904
50—4
13.984
29.773
26.285
50—5
15.033
35.286
29.273
100—1
15.925
34.989
29.604
100—2
11.027
32.214
25.762
100—3
17.281
40.708
33.49
100—4
10.791
26.414
22.562
100—5
10.855
35.576
27.957
150—1
15.043
34.817
29.512
150—2
19.41
40.81
34.517
150—3
14.31
31.664
26.99
150—4
18.723
37.36
32.115
150—5
15.779
29.633
26.28
200—1
10.989
27.489
23.222
200—2
16.68
30.69
27.102
200—3
13.831
27.83
24.419
200—4
13.395
30.002
25.203
200—5
15.221
30.137
26.285
植物含水量测定
编号
培养皿重（g）
培养皿+植株（g）
烘干后（g）
植株含水量
0—1
35.949
38.601
36.423
82.1267%
0—2
40.964
47.105
41.845
85.6538%
0—3
45.77
50.921
47.382
68.7051%
0—4
35.419
38.031
35.844
83.7289%
0—5
35.596
40.598
36.383
84.2663%
50—1
32.486
43.854
33.895
87.6056%
50—2
34.9
40.362
35.76
84.2549%
50—3
42.291
47.674
43.029
86.2902%
50—4
35.122
40.239
35.92
84.4049%
50—5
32.447
42.74
33.883
86.0488%
100—1
32.577
38.942
33.492
85.6245%
100—2
32.866
38.592
33.638
86.5176%
100—3
28.996
43.297
31.089
85.3647%
100—4
45.629
53.34
46.746
85.5142%
100—5
38.413
48.732
39.486
89.6017%
150—1
33.25
49.856
35.344
87.3901%
150—2
33.532
43.099
34.998
84.6765%
150—3
38.657
48.947
40.038
86.5792%
150—4
33.263
41.694
34.462
85.7787%
150—5
31.753
38.197
32.703
85.2576%
200—1
29.286
43.555
31.329
85.6822%
200—2
30.208
51.674
32.785
87.9950%
200—3
36.193
48.237
37.815
86.5327%
200—4
35.763
51.245
37.923
86.0483%
200—5
45.462
57.478
47.105
86.3266%
有图表可知：
植物生长中因土壤含有一定的重金属，致使植物体内含水量急速增加，但是随着铜离子浓度增长其含水量并不因其增长而发生一定规律的变化，可以知道，一旦土壤中含有重金属，植物吸收到重金属后，改变了植物的生理特性，致使植物生物学结构发生变化，引起植物的蒸腾作用和其他作用发生了改变，造成影响。
土壤微生物呼吸作用的测定—氢氧化钠吸收法
编号
土壤鲜重/g
滴定消耗盐酸初值/ml
滴定消耗盐酸终值/ml
差值/ml
二氧化碳释放量/mg
0—0
1.71
19.32
17.61
0—1
30.2646
19.33
36.39
17.06
1.21
0—2
30.3446
1.41
18.26
16.85
1.672
0—3
30.2176
18.28
34.78
16.5
2.442
0—4
30.6951
0.31
16.99
16.68
2.046
0—5
30.2241
0.75
17.55
16.8
1.782
50—0
0
3.69
21.3
17.61
50—1
30.981
0.77
17.31
16.54
2.354
50—2
31.785
1.37
18.71
17.34
0.594
50—3
30.69
0.23
17.3
17.07
1.188
50—4
30.829
0.9
17.4
16.5
2.442
50—5
31.335
0.85
17.69
16.84
1.694
100—0
0
19.01
36.88
17.87
100—1
29.9639
16.61
32.58
15.97
4.18
100—2
30.1741
2.32
18.15
15.83
4.488
100—3
29.9539
18.18
33.98
15.8
4.554
100—4
30.6719
0.71
16.89
16.18
3.718
100—5
30.3648
17.7
32.1
15.4
5.434
150—0
0
1.51
18.98
17.47
150—1
29.6858
0.19
15.68
15.49
4.356
150—2
30.2008
15.69
30.65
14.96
5.522
150—3
30.5611
0.84
16.49
15.65
4.004
150—4
31.5805
16.5
31.81
15.31
4.752
150—5
31.863
11.09
25.79
14.7
6.094
200—0
0
0.3
17.35
17.05
200—1
29.78
17.36
34.76
17.4
-0.77
200—2
29.973
0.8
18.19
17.39
-0.748
200—3
29.713
18.2
35.8
17.6
-1.21
200—4
30.106
1.2
18.8
17.6
-1.21
200—5
29.741
19.12
36.57
17.45
-0.88
有图表可知:
随着铜离子浓度发生变化，土壤的二氧化碳释放量变化急剧，甚至铜离子浓度达到一定浓度之后，土壤不再因呼吸作用而释放二氧化碳。
表明：
在铜离子浓度一定范围内土壤微生物尚且能适应其生活环境，随着铜离子浓度增加后微生物增加其呼吸作用强度以适应其生活环境，但是铜离子浓度达到一定高度后，微生物不能再适应该生活环境，大量死亡。
土壤微生物量C测定--熏蒸-浸提法
编号
硫酸亚铁铵滴定初值/ml
硫酸亚铁铵滴定终值/ml
差值/ml
未0—0空白
1.58
9.23
7.65
未0—1
28.42
35.72
7.3
未0—2
14.3
21.61
7.31
未0—3
0.6
7.9
7.3
未0—4
30.7
38.02
7.32
未0—5
23.5
30.68
7.18
0—0空白
9.25
16.93
7.68
0—1
35.72
42.65
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