天然药物化学实验docWord格式.docx

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2．目的要求

3．基本原理主要的提取分离及鉴定原理。

4．步骤简明扼要概括实验步骤，包括现象记录。

5．实验结果包括化学反应的试剂、现象及结论，色谱鉴定条件，产品颜色、晶形、重量、熔点以及得率等。

6．讨论包括实验过程中主要注意事项、关键步骤、实验成败的原因及心得体会。

7．思考题可以根据老师的要求，回答各实验中的某些思考题。

实验报告要求字迹端正，图表清楚．叙述有条理，尽量做到既有观察的实验现象又有说明和解释；

既有实验数据又有分析和结论；

既有成败的经验教训又有自己的实践体会，甚至有改进的建议。

一、实验要求

1.掌握薄层板的制备及薄层层析的操作方法

2．掌握吸附剂活度测定的原理及方法

3．应用薄层层析法检测中草药化学成分

二、实验原理

当一个混合物被倒入固定相中，并用另一个流动相洗脱时，由于混合物中各组份与固定相和流动相的相互之间的作用不同，致使各组份通过固定相的速率不同，从而使混合物中各组份得到分离。

三、实验仪器与试剂

仪器：

烘箱，玻璃板，研钵，水浴锅，天平，薄层涂布器

试剂：

氧化铝，纤维素，聚酰胺,硅胶,羧甲基纤维钠，甲酸，0.01%二甲基黄、苏丹红，靛酚蓝，苯，偶氮苯，对甲氧基偶氮苯，苏丹黄，苏丹红，对氨基偶氮苯，四氯化碳

四、实验步骤

（一）薄层板的制备

1.加粘合剂的薄层涂布法

（1）氧化铝薄层

将吸附剂置于薄层涂布器中，调节涂布器的高度，向前推动，即得均匀薄层。

本实验主要用下述简易操作涂布薄层，取表面光滑、直径统一的玻璃一支，依据所制备薄层的宽度、厚度要求，在玻璃棒两端套上厚度为0.3~1mm的塑料圈或金属环，并在玻璃棒一端一定距离处套上较厚的塑料圈或金属环，以使玻璃棒向前推动时能保持平行方向，操作时，将氧化铝粉均均地铺在玻璃板上，匀速向前推动。

（2）纤维素薄层

一般取纤维素粉1份加水约5份，在烧杯中混合均匀后，倒在玻璃板上，轻轻振动，使涂布均匀，水平放置，待水分蒸发至近干，于100±

2℃干燥30~60分钟即得。

（3）聚酰胺薄层

取锦纶丝（无色干净废丝即可）用乙醇加热浸泡2~3次，除去腊质等。

称取洗净的锦纶丝1克，加85%甲酸10ml，在水浴上加热使溶，再加70%乙醇6ml。

继续加热使完全溶解成透明胶状溶液。

将此溶液适量倒在水平放置的，用清洁液洗净的玻璃片上，并自然向周围推匀，厚度约0.3mm，薄层太厚时，干后会裂开。

将铺好的薄层水平放在盛温水的盘上，使盘中的水蒸汽能熏湿薄层，盘子加玻璃板盖严密，薄板放置约1小时完全固化变不透明白色，再放数小时后，泡在流水中洗去甲酸，先在空气中晾干，后在烘箱中0℃恒温加热活化15分钟，冷后置干燥器中贮存备用。

2．加粘合剂薄层的涂布法

（1）硅胶G薄层取硅胶G或硅胶GF一份，置烧杯中加水约5份混合均匀，放置片刻，随即用药匙取一定量，分别倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推动涂布），均匀涂布成0.25~0.5mm厚度，轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀，在水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中100℃活化0.5~1小时，冷后贮于干燥器内备用。

活化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只需在空气中自然干燥，不经活化即可贮存备用。

（2）硅胶（H）羧甲基纤维钠（CMC-Na）薄层取羧甲基纤维素0.2g，溶于25ml水中，在水浴上加热搅拌使完全溶解，倒入烧杯中，加薄层层析用硅胶（颗粒度10~40μm的约6~8g）混成均匀的稀糊，按照硅胶G薄层涂布法制备薄层，或取0.8%羧甲基纤维纳10ml，倒入广口瓶（高约10~12cm）中，然后逐步加入薄层层析用硅胶3.3克，不断振摇成均匀的稀糊，把两块载玻片面对面结合在一起，这样每片只有一面与硅胶糊接触，使薄片浸入硅胶稀糊中，然后慢慢取出，分开二块薄片，将未粘附硅胶糊的那一面水平放在一张清洁的纸上，让其自然阴干，100℃下烘30分钟。

冷后于干燥器内备用。

未消耗的硅胶稀糊可贮存在广口瓶内，以供再用。

氧化铝薄层、氧化铝羧甲基纤维钠薄层的制备方法同上，一般所需要氧化铝比硅胶稍多。

目前国内外市场有预先制好的薄层板，底板用玻璃、塑料、铝片等。

可按需要用玻璃刀划割，也有用剪刀剪成所要的大小，使用方便，价格贵些。

3．特殊薄层的制备

根据分离工作的特殊需要，可制成以下几种特制薄层。

（1）酸、碱薄层和pH缓冲薄层

为了改变吸附剂的酸碱性，以改进分离效果，可在吸附剂中加入稀酸溶液（如0.1~0.5N草酸溶液）代替水制成酸性氧化铅薄层使用。

硅胶微呈酸性，可在铺层时用稀碱溶液（如0.1~0.5N氢氧化钠溶液）代替水制成碱性的硅胶薄层。

可用醋酸钠、磷酸盐等不同pH的缓冲液代替水铺层，制成一定pH缓冲的薄层。

羧甲基纤维素钠溶液一般用0.5~1%浓度，宜预先配制后静置，取其上层澄清溶液应用，则所制得的薄层表面较为细腻平滑。

常用0.8%浓度。

CMC-Na系中粘度、300~500厘泊（粘度单位）。

CMC-Na系碳水化合物，调制时应在水浴上进行。

活化温度不应过高，防止碳化。

（2）络合薄层

硝酸银薄层的制法，可在吸附剂中加入5~25%硝酸银水溶液代替水制成均匀糊状，再按常法铺成薄层，制成薄层避光阴干，于105℃活化半小时后避光贮存。

制成的薄层以不变成灰色为好，在三天内应用。

也可先把硝酸银用少量水溶解，再用甲醇稀释成10%溶液，把预先制好的硅胶G薄层浸入此溶液中约1分钟，取出避光阴干，按上法活化，贮存。

（二）吸附剂的活度测定

1.氧化铝活度的测定

一般可用4~5种偶氮染料以薄层层析法进行测定。

染料试剂的配制：

取偶氮苯（Azobenzene）50mg，对甲氧基偶氮苯（P-Methoxyuzobenzene）,苏丹黄（SudanI,Benzeneazo-β-naphthol），苏丹红（SudanⅢTetrazobenzol-β-naphthol），对氨基偶氮苯（P-Aminoazobenzene）各20mg，分别溶于50ml重蒸馏的四氯化碳（经氢氧化钠干燥）中。

常法制备不含粘合剂氧化铝薄层，以铅笔尖或毛细管尖在薄层板一端2~3cm处间隔1cm左右轻轻点上5个可以看清的小点。

各吸取约0.02ml染料试剂分别点于原点上，以四氯化碳为展开剂，展开时薄层板与容器底部交角为10~40°

之间，展开后测出各斑点的Rf值，从表1确定氧化铝的活度（一般高活性氧化铝Ⅰ~Ⅲ级活度使用本法时，结果往往偏低）。

另取不含粘合剂氧化铝薄层板一块，置于水蒸汽饱和容器内，2~3小时后取出，按上述方法测定活度。

观察有无变化。

2．硅胶活度的测定

一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。

欧洲药典1969年记载用0.01%二甲基黄（Dimethy-yellow.P-Dimethylaminoazobenzene）、苏丹红（SudanⅢ）、靛酚蓝（Indophenolblue4-Tapnthoquinone-4-dimethylaminoaniline）的苯溶液各10μl点滴于硅胶G或硅胶H薄层上，以苯为展开剂，展开10cm（约20分钟），三种染料应明显分离。

靛酚蓝斑点接近于起始线，二甲基黄斑点在薄层的当中，苏丹红斑点在两斑点之间，则认为薄层板活性符合要求。

国内青岛海洋化工厂出售薄层层析用的硅胶在吸附剂名称之后加几个字标明的意思是：

硅胶G（G是Gypsum石膏的缩写，表示加了石膏），硅胶H（H表示不加石膏），硅胶GF254（F254表示加石膏和在波长254nm处显绿色荧光的硅酸锌锰），硅胶GF365（表示加石膏和在波长365nm处显黄色荧光的硫化锌镉）。

氧化铝则类推。

表1氧化铝活度与偶氮染料比移值关系

偶氮染料

氧化铝活度级Rf值

二级

三级

四级

五级

偶氮苯

0.59

0.72

0.85

0.95

对甲氧基偶氮苯

0.16

0.45

0.69

0.89

苏丹黄

0.02

0.25

0.87

0.98

苏丹红

0.00

0.10

0.35

0.50

对氨基偶氮苯

0.05

0.08

0.19

（三）薄层层析的应用

薄层层析法在中草药化学成分的研究中，主要应用于化学成分的预试、化学成分的鉴定及探索柱层分离的条件。

用薄层层析进行中草药化学成分检识，可依据各类成分性质及熟知的条件有针对性地进行。

由于在薄层上展开后，可将一些杂质分离，选择性高，可使预试结果更为可靠，不仅可通过显色获知成分类型，而且可初步了解主要成分的数目及其极性大小。

例一：

湖北贝母生物碱成分的TLC检识

吸附剂：

硅胶CMC-Na薄层

样品：

湖北贝母总生物碱氯仿溶液

展开剂：

C6H6-EtOAc-NHEt2（6：

4：

1）

显色剂：

改良碘化铋钾喷雾

例二：

丹参色素的TLC检识

硅胶G-CMC-Na板

丹参乙醚提取液

石油醚-乙酸乙酯（9：

记录TLC结果

五、问题与讨论

1.硅胶、氧化铝、聚酰胺各适合于分离哪些类型的化合物？

2.什么是制备薄层？

简要写出其操作过程。

3.什么是边缘效应？

怎样产生的？

如何克服？

实验二粉防已生物碱的提取分离与鉴定

一、实验目的要求

1．掌握生物碱的一般提取方法。

2．用低压柱层析分离、纯化单体的方法及薄层层析鉴定

汉防己为防己科千金藤属物StephaniatetrandraS.Mcore的根，是祛风解热镇痛药物，其有效成分为生物碱，主要是汉防己甲素和汉防已乙素。

临床上除用作治疗高血压、神经性疼痛、抗阿米巴原虫外，还将粉防已生物碱的碘甲基或溴甲基化合物作为肌肉松弛剂应用。

此外，汉防已甲素在动物实验中有抗癌和扩张血管的作用。

汉防已根中总生物碱含量为1.5~2.3%，主要为汉防已甲素，含量约1%；

汉防已乙素，含量约0.5%；

轮环藤酚碱，含量为0.2%；

以及其它数种微量生物碱。

1.汉防已甲素（Tetrandrine，汉防已碱，粉防已碱）

无色针晶，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等有机溶剂及稀酸水中，可溶于苯。

Mp216℃，有双熔点现象，自丙酮中结晶者，150℃左右熔后加热又固化，至213℃复熔。

2.汉防已乙素（Fangchinoline,又称防已诺林碱，去甲粉防已碱）

溶解行为与汉防已甲素相似，因有一个酚羟基，故极性较汉防已甲素稍高，在苯中的溶解度小于汉防已甲素而在乙醇中又大于汉防已甲素，籍此可以相互分离。

用不同溶剂重结昌时，其晶形和溶点不同：

乙醇细棒状结晶mp245~6℃

甲醇细棒状结晶mp177~9℃

丙酮六面粒状晶mp134℃

吡啶-甲醇mp121~2℃

环已烷-乙酸乙酯mp156℃

3.轮环藤酚碱（Cylanoline）

为水溶性季铵生物碱，不溶于极性溶剂，氯化物为无色，八面体状结昌，mp214~6℃；

碘化物为无色绢丝状结晶，mp185℃；

苦味酸盐为黄色结晶，mp154~6℃。

渗漉筒，抽滤瓶，索氏提取器，真空泵，低压柱，空压机，烘箱，天平

汉防已，0.5%H2SO4，新鲜石灰乳，乙醚，95%乙醇，NaCl，硅胶，丙酮，环已烷，乙酸乙酯，二乙胺，改良碘化铋钾

1.生物碱的提取分离

（1）总生物碱的提取及亲脂性与亲水性生物碱的分离

汉防已药材粗粉100g

↓0.5%H2SO4液渗漉（注一）

酸水渗漉液（为原料的3~10倍量V/V）

↓加新鲜石灰乳调pH9~10，静置，抽滤

↓↓

泥黄色沉淀碱水液

（水溶性季铵碱及水溶性杂质）

将沉淀与净砂拌匀（注二）

80℃烘干，置索氏提取器中用乙醚（约180ml）提取至

提尽生物碱（注三）

回收乙醚（注四）

乙醚提取物

用95%乙醇40~60ml回流热溶后

倾入500ml水中，加30gNaCl盐析

水溶上加热至凝结，静置

抽滤

白色沉淀（亲脂性叔胺总碱，以汉防已甲素、乙素为主）

注一：

将汉防已药材粗粉加适量酸水液，以能将生药粉末润湿为度（约150ml），充分拌匀，放置半小时，均匀而致密地装入渗筒内，用锥形瓶底部或其它平底工具压紧，供渗漉用，流速约1.5ml/分。

注二：

净砂必须事前洗净烘干，拌和量最好不要超过120g，以免索氏提取器一次装不下或装得过多，提不尽生物碱。

注三：

检查生物碱是否提尽的方法，是取最后一次乙醚提取液约数滴，挥去乙醚，残渣加5%HCl0.5ml溶解后，加改良碘化铋钾试剂一滴，无沉淀折出或明显浑浊时，表明生物碱已提尽，或基本提尽。

反之，应继续提取。

注四：

先将提取器内滤纸筒取出。

然后将提取玻璃筒内最后一次乙醚提取液倾出（另器贮存），再将提取玻璃筒安装好，继续加热，回收烧瓶中乙醚于玻璃筒中，至烧瓶内的乙醚提取液体积较小时，停止回收，将烧瓶中乙醚提取液倾出。

2.低压柱层析分离汉防已甲素和乙素

低压柱层析在低压下（0.5~3kg/cm2，一般0.3~1.2kg/cm2）采用颗粒直径介于经典柱层析（100~200μm）和HPLC（~37μm）之间的薄层层析用硅胶（或氧化铝）H或G（50~75μm）作为填充剂的一种层析柱，其基本原理与HPLC相同，分离效果也介于经典柱与HPLC之间。

用减压干法装柱，铺层紧密均匀，层析带分布集中整齐，同时薄层层析的最佳分离溶剂系统可以直接用于低压柱层析。

它是一种分离效果较好，设备简单，操作方便，快速的方法，适宜于天然产物的常量制备性分离。

（注）气体输入装置，可采用小型空气压缩机或氮气钢瓶

3.装柱减压干法装法，层析柱规格：

柱长30cm，内径2cm，共装硅胶约30g（高约22cm）。

（1）拌样加样取汉防已碱约150mg，加少量丙酮热溶（刚溶为度）用滴管加到1.5g硅胶上，仔细拌匀，水浴上蒸干，碾细，通过一个长颈漏斗小心加在柱顶，轻轻垂直顿击，待样品表面平整不拌动时，上面再盖约1~2cm高的空白硅胶，再加盖一园形滤纸片，压紧。

（2）洗脱先检查从空压机至层析柱各阀门管道是否正常，关紧各个阀门，开动空压机至额定压力（5.8kg/cm2）待用。

用滴管顺层析柱柱壁仔细加入少量洗脱剂（环已烷-乙酸乙酯-二乙胺/6：

2：

0.8），当液面达到一定高度时，再一次加入其余洗脱剂（共约250ml），迅速在柱顶上装上玻璃标口塞接头，用铁夹夹紧（防加压时接头冲开）。

小心开启空压机阀门，再开针形阀和空气过滤减压器

（注意：

压力过大，玻璃柱会炸，一般2kg是安全的，必要时可戴防护面罩）。

调动所需压力，0.6~1.2kg/cm2，约40分钟后流出，控制流速1ml/min，每10分钟左右一管，收12~15份，洗脱全过程约3小时。

（3）检查各流份分别移入小玻璃蒸发器中，于水浴上浓缩，分别通过TLC检查，吸附剂：

硅胶G，展开剂：

环已烷-乙酸乙酯-二乙胺/6：

3：

1，改良碘化铋钾试剂喷雾显色，以汉防已甲素、乙素为标准品对照，合并相同组分，分别获得甲、乙素粗品，用丙酮重结晶，测定mp。

（二）鉴定方法

1.衍生物制备

取汉防已甲素0.2g，溶于2ml丙酮中，滴加苦味酸饱和水溶液至不再析出黄色沉淀为止。

抽滤收集沉淀，顺次以少量水、乙醚洗涤，乙醇重结晶，得汉防已甲素苦味酸盐，mp235~242℃（dc）。

2.有机胺碱的TLC

青岛海洋化工厂薄层层析硅胶G，用0.3%CMC-Na水液制板，110℃活化1小时。

分出的汉防已甲素①、乙素②、总碱③

环己烷-EtOAc-NHEt2（6：

改良碘化铋钾试剂（展开后用电吹风吹干再喷显色剂，以免二乙胺干扰）

现象：

甲素显色后显淡棕色，2小时左右就褪色，而乙素显棕色，久置不褪色，可帮助其辨认。

1.试比较汉防己甲素、乙素的极性大小，并预测低压柱分离时他们流出的先后顺序。

2.简述影响生物碱碱性的因素。

实验三掌叶防己碱的提取与分离及延胡索乙素制备

1.掌握季铵生物碱的一种提取方法。

2.掌握生物碱的一般理化性质及其结构与性质的关系。

3.了解黄藤生物碱的结构与性质的关系。

4.熟悉生物碱沉淀反应的条件和方法。

5．掌握制备生物碱结晶性盐的方法和精制。

6．掌握四氢巴马汀的制备方法。

掌叶防已碱又称巴马汀（palmatine），硫酸延胡索乙素又称消旋四氢巴马汀硫酸盐（dltetrahydropalmatinesulphate）。

延胡索乙素（CorydalisB）为镇静安定药，用于缓解胃系统的疾病所引起的疼痛、临产阵痛、头痛、失眠等。

中药延胡索（元胡，CorydalisyanhusuoW.T.Wang的块根）中含延胡索乙素的量很少，而其脱氢化合物巴马汀在某些植物中含量却很高。

在中国华南一带的防已科植物黄藤（Fibreursarecisapaerre）的根茎中含巴马汀，再经氢化反应，制备延胡索乙素。

黄藤曾列入《本草纲目》，李时珍谓“藤生生岭南，状若防已，但人常服此藤，纵饮食有毒，亦自然不发”。

现代民间作为清热消炎药，常用于外伤感染、扁桃体炎、咽喉炎、结膜炎、热痢及黄疸等。

黄藤根茎及根中所含成分主要为巴马汀，尚含少量药根碱、黄藤素甲、黄藤素乙、内脂及甾醇，又谓在根茎、根及树皮中含小檗碱。

1．掌叶防已碱（巴马汀，Palmatine）

本品系季铵生物碱，溶于水、乙醇，几乎不溶于氯仿、乙醚、苯等溶剂，掌叶防已碱盐酸盐即氯化巴马汀（palmationChloride）C21H22O4N·

Cl·

3H2O为黄色针状结晶，熔点205℃（分解），其理化性质与盐酸小檗碱类似。

巴马汀氢碘酸盐（palmatineicdide）C21H22O4N·

I·

2H2O为橙黄色针状结晶，熔点241℃（分解）。

2.药根碱（雅托碱·

Jatrorrhizine）

本品系具酚羟基季铵盐，其理化性质与巴马汀类似，但较易溶于苛性碱液中，其盐酸在水中的溶解度亦比盐酸巴马汀为大，可籍此性质予以分离。

药根碱盐酸盐（JatrorrhizineChloride）C20H20O4N·

H2O为铜色针状结晶，溶点204~206℃，其苦味酸盐（Jatrorrizinepicrate）C20H20O4N·

C6H2O7N2为橙黄色柱状结晶，溶点217~220℃（分解）。

3.小檗碱（黄连素Berberine）

本品系季铵生物碱，其游离碱为黄色长针状结晶，C20H18O4N·

OH·

5

H2O，溶点145℃，在100℃干燥，失去结晶水转为棕黄色。

小檗碱能缓缓溶于水（1：

20）、乙醇（1：

100），较易溶于热水、热乙醇，微溶于丙酮、氯仿、苯，几乎不溶于石油醚中。

小檗碱与氯仿、丙酮、苯均能形成加成物。

小檗碱盐酸盐（BerberineChloride）C20H16O4N·

Cl2H2O，熔点205℃（分解），微溶于冷水，较易溶于沸水，其硝酸盐及氢碘酸盐，极难溶于水（冷水约1：

2000），小檗碱的中性硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐在水中溶解度较大。

小檗碱的盐类在水中的溶解度：

盐酸小檗碱1：

500

硫酸小檗碱1：

30（酸性盐1：

100）

枸橼酸小檗碱1：

125

磷酸小檗碱1：

15

4.四氢巴马汀（Tetrahydropalmatine）:

延胡索乙素为消旋四氢巴马汀，系叔胺碱，其游离碱C21H25O4N溶点146~148℃，不溶于水，能溶于热乙醇（在冷乙醇中溶解度较小），易溶于氯仿、苯、乙醚中。

延胡索乙素的酸性硫酸盐为无色针状结晶，溶点245~246℃，在冷水中溶解度较小，在热水中较大。

其中性硫酸盐为长柱状结晶，熔点220℃，在水中溶解度较酸性硫酸盐为大，其盐酸盐难溶于水。

左旋四氢巴马汀即颅痛定（Rotundine）熔点141~142℃，[α]D16-257.5°

（C=1.1氯仿）。

本品在华千金藤（StephaniasinicaDiels）及圆叶千金藤（S.rotundalour）的块根（山乌龟）中含量较多。

5．黄藤素甲

本品为制备氯化巴马汀的乙醇母液中的少量成分，为季铵碱盐的盐酸盐C26H29O7N·

HCl·

H2O熔点196~198℃，[α]

+273.3°

（C=1，乙醇），其还原物为白色针状结晶，熔点134~186℃，[α]

+146.6°

（C=1，酸）。

6．黄藤素乙

本品系粗制巴马汀氢化、碱化分去四氯巴马汀后母液中的微量物质，溶于氯仿。

以氯仿-乙醇重结晶得黄色结晶，熔点192~193℃，[α]

+233.3℃（C=1，氯仿）。

7．黄藤内酯

本品得自粗氯化巴马汀重结晶的不溶于水物质中，反复以酒精、丙酮重结晶，得光亮棱状结晶，C27H23O9，熔点273℃，[α]

+36.60℃（C=1，乙醇）。

8．黄藤甾醇

本品得自制备氯化巴马汀的乙醇母液中，分出的少量油层经10%KOH皂化得到的白色针晶，熔点136~137℃，[α]

+24.51℃（C=1，氯仿）。

9．主要提取成分的理化性质：

（1）氯化巴马汀：

Mp209~210℃（分解）

UVλMeOHmaxnm:

224,265-273,337-347,430

λMeOHminn