生化检验技术实验.docx
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生化检验技术实验
生物化学检验
2011级春季班
检验实验室编
实验一 常用玻璃器皿的清洗及干燥
【目的要求】
学会常用玻璃器皿的清洗及干燥方法。
【实验器材】
1.电热恒温干燥箱。
2.新购置的、日常用过的、被油脂类污染的以及假定被传染性标本污染过的容量瓶、刻度吸管、量筒、量杯、试管、烧杯若干；各种类型的大小毛刷若干。
【实验试剂】
1.清洁液（重铬酸钾洗液）称取重铬酸钾50g加蒸馏水50ml溶解后，将500ml浓硫酸缓缓加入上液中（切忌不可将重铬酸钾溶液倾入浓硫酸中），边加边用玻棒小心搅拌，以免产生高热而使容器破裂，配好放冷，装瓶加塞备用（防止浓硫酸吸水降低去污能力）。
2.2%盐酸溶液、2%次氯酸溶液。
3.洗衣粉。
【操作步骤】
（一）洗涤
1.新购置的玻璃器皿都附有游离碱，应先置2%盐酸溶液中浸泡2～6小时，以除去游离碱。
取出后用自来水冲洗后，置2%洗衣粉溶液中，用毛刷刷洗。
取出再用自来水反复冲洗，最后，用蒸馏水淋洗2～3次即可。
2.日常用过的玻璃器皿先用自来水冲洗，再置2%洗衣粉溶液中用毛刷刷洗，自来水冲洗，最后，用蒸馏水淋洗2～3次即可。
3.不能用毛刷刷洗的器皿如容量瓶、刻度吸管等，可先用自来水冲洗沥干后，再用重铬酸钾洗液浸泡过夜，沥干洗液后用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗2～3次。
4.对传染性标本污染过的器皿，应先将其中所含试样倒入盛有2%次氯酸溶液的容器中，先用水冲洗后，浸泡在铬酸洗液中过夜，再用自来水和蒸馏水冲洗。
吸管、滴管类器皿用后应立即放在盛有消毒液（如过氧乙酸）的玻璃筒内浸泡，次日取出，流水冲洗，滤干后，浸泡在铬酸洗液中过夜，再用自来水和蒸馏水冲洗。
5.被石蜡、凡士林或其他油脂类污染的玻璃器皿要单独洗涤，洗涤前，首先去油脂（将器皿倒放于具有强吸水力的几层厚纸上，置100℃烤箱中烘烤半小时，使油脂熔化由厚纸吸收，再置碱性溶液中煮沸趁热洗刷，即可去除油脂），然后再按一般洗涤要求进行。
（二）干燥
1.自然干燥将洗净的不能用高温烘烤的器皿，如量筒、量杯、容量瓶、吸管等倒挂在晾架上，待其自然晾干。
2.烘烤干燥除因高温使玻璃变形，改变容积，影响实验结果的玻璃量器外，其它玻璃器皿如试管、烧杯、三角烧瓶等，均置于100～120℃左右烤箱中烘烤干燥。
【结果报告】
【讨论分析】
实验二 吸收曲线绘制及721型分光光度计波长校正
【目的要求】
1.了解可见光分光光度法在定性分析中的应用；
2.学习721型分光光度计的使用方法；
3.学会吸收曲线绘制及波长校正方法。
【实验原理】
光源通过棱镜色散成连续光谱，转动准直镜使色散光谱中某一部分由出光狭缝射出而成一单色光束，该光束的主波长由随同准直镜转动的波长刻度盘指示。
刻度盘读数与出射光束实际波长是否相符，可通过测绘已知吸收峰波长的标准溶液或标准滤光片（如镨钕滤光片）的吸收曲线而确定。
不同物质，由于其分子结构的差异，对光谱吸收的特性不同。
吸光度最大时的波长称为特征波长，以吸光度对波长所作的曲线叫吸收曲线（A-λ），吸收曲线可作为定性分析的理论依据。
镨钕滤光片在可见光区内有许多固定不变的吸收峰，通常选择529nm的吸收峰（λmax为529nm时吸光度最大），如果偏离529±2nm（超过允许误差波长）时应进行波长校正。
【实验器材】
721分光光度计（结构见图1-2-2），分光光度计配件——镨钕滤光片、滤光片支架，白卡纸，螺丝刀，坐标纸。
图1-2-2 721型分光光度计结构
1.光源室；2.电源变压器；3.稳压电路控制板；4.滤波电解电容
5.光电管盒；6.比色室；7.波长选择磨擦轮；8.单色光器组件
9.“0”粗调电位器；10.读数表；11.稳压电源功率管
一、吸收曲线绘制
【操作步骤】
1.接通仪器电源，预热20分钟。
2.待仪器稳定后将镨钕滤光片（水红色）固定于滤光片支架，置于比色皿座上。
转动波长调节旋钮，使波长刻度盘读数为520nm，以空气调零、调“T”旋钮至100%，将镨钕滤光片推向光路并记录吸光度值（每一波长重复测定3次）。
3.按表1-2-1中各波长，重复上述步骤（每次均须重新调零和调100%），记录数据。
表1-2-1 不同波长处镨钕滤片的吸光度
λ（nm）
A1
A2
A3
λ（nm）
A1
A2
A3
520
532
522
534
524
536
526
538
528
540
530
－
【结果处理】
1.取方格坐标纸，以波长为横坐标、吸光度为纵坐标（每1小格为0.01A）建立直角坐标。
2.将不同波长处测得吸光度的平均值按相应波长在坐标纸上标出。
3.连接各点，即可得到所测标准滤光片的吸收曲线。
4.观察指定吸收峰波长（实测值）与标度值是否相符，若不符合，即两者存在偏差。
偏差值在±2nm以内，波长误差在允许误差范围；偏差的绝对值＞2nm（超过允许误差），则应进行波长校正。
二、波长校正
【操作步骤】
（一）粗调
1.接通仪器电源，预热20分钟。
2.选择开关置于“T”位，旋转波长至580nm。
3.将白卡纸放入比色室暗箱光电管一侧，转动光量旋钮，直至白卡纸上的光斑清晰可辩。
观察光斑的形状应为边缘整齐、着色均匀的长方形，光斑呈黄色。
4.若光斑边缘不齐、着色不均应考虑调整光源灯位置，若光斑呈色偏绿、偏红则说明波长不准。
（二）精调
1.光源灯的更换和调整 721分光光度计的光源灯采用12V30W钨灯，更换钨灯时应先切断电源，然后用附件中的扳手旋松钨灯架上的两个紧固螺丝，取出损坏的钨灯，戴上手套，换上新钨灯后，将波长选择在580nm，开启主机电源开关，移动钨灯上、下、左、右位置，直到成像在入射狭缝上。
观察光斑的形状应为边缘整齐、着色均匀的长方形，光斑呈黄色即可，最后将两颗紧固螺丝旋紧。
2.镨钕滤光片直接校正法 该法操作简便易行。
（1）接通仪器电源，预热20分钟；
（2）将镨钕滤光片固定于滤光片支架，置于比色皿座内，旋转波长至528（或530）nm处，以空气调零、调“T”旋钮至100%；
（3）用螺丝刀卸下仪器侧面板上的四颗固定螺丝，按说明书指示找准波长调节螺杆；
（4）手握螺丝刀，缓慢转动波长调节螺杆，同时观察读数表盘上吸光度变化（吸光度下降应反向转动）直至调至最大（透光度则为最小）为止；
（5）读取特征波长附近各10nm（间隔2nm测定一次）的吸光度值验证无误后，上好侧面板。
【结果报告】
【讨论分析】
实验三 缓冲液离子强度对电泳速度的影响
【目的要求】
1.学习电泳的一般原理和方法，初步掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白质技术；
2.观察并比较不同缓冲液离子强度（I）对电泳速度的影响。
【实验原理】
根据Stoke定律，带电颗粒在电场中，受电场力作用向着电性相反方向移动的速度，与颗粒所带电荷量与电场强度乘积成正比，与颗粒半径成反比。
同种物质在电场强度、电泳时间、缓冲液pH相同条件下，电泳迁移率与缓冲液离子强度成反比。
【实验器材】
1.实验器材新鲜人血清，醋酸纤维素薄膜（CAM），滤纸，竹镊子，血清加样器。
2.仪器电泳仪（0～300V，0～50ｍA），普通电泳槽。
【实验试剂】
1.巴比妥盐缓冲液
（1）巴比妥盐缓冲液（pH8.6，离子强度0.06） 称取巴比妥钠（C8Hl1O3N2Na）12.76g、巴比妥（C8H12O3N2）1.66g，加蒸馏水约500m1加热溶解，待冷至室温，用蒸馏水加到1L。
（2）巴比妥盐缓冲液（pH8.6，离子强度0.03） 取
（1）液用蒸馏水稀释一倍即成。
2.氨基黑10B染色液 称取氨基黑10B0.5g，加冰醋酸10ml，甲醇50ml，充分研磨溶解后用蒸馏水补足到100ml。
3.漂洗液 甲醇（或乙醇）45ml，加冰醋酸5m1，蒸馏水补足到100ml。
【操作步骤】
1.薄膜准备将醋酸纤维素薄膜裁成2×8cm大小，在膜的粗面上距膜一端1.5～2.0cm处用铅笔轻轻划一条点样线，标明编号；将薄膜分别置于离子强度0.06和离子强度0.03的缓冲液中，大约20分钟，浸透为止。
加样前取出，用滤纸吸去表面多余的缓冲液。
2.点样用血清加样器沾取血清少许，垂直印在醋酸纤维素薄膜点样线上，立即将醋酸纤维素薄膜分别放入相应离子强度的电泳槽支架上，用滤纸作盐桥与缓冲液相通，注意将点样面朝下，点样端置于阴极端。
3.平衡盖上电泳槽盖，使醋酸纤维素薄膜通过滤纸桥吸足缓冲液约5分钟。
4.电泳电压100～150V，电流0.4～0.6ｍA/cm宽。
通电约40～50分钟，待白蛋白移动距离约2～3cm时，记录电泳时的电压、电泳时间，关闭电源，测量支持介质的有效长度。
5.染色取出薄膜，可直接浸入染色液中，染2～3分钟后取出，再用漂洗液漂洗数次，直到背景干净为止。
【结果分析】
1.利用所记录的电泳电压（V）、支持物有效长度（l，单位为cm）、电泳时间（ｔ，单位为s）和白蛋白移动的距离（ｄ，单位为cm），分别计算用离子强度0.03和0.06的白蛋白的迁移率，判断离子强度对电泳速度的影响。
迁移率计算公式如下：
＝＝＝（cm2.V-1.s-1）
图1-3-1 血清蛋白CAM电泳图谱
2.比较离子强度0.03和0.06的缓冲液的电泳图形，判断在哪种离子强度下进行蛋白质电泳较好。
血清蛋白CAM电泳图谱如图1-3-1。
3.观察CAM电泳可将血清蛋白质分成几种成分？
各成分的区带位置及相对含量高低。
【结果报告】
【讨论分析】
实验四 血糖测定
一、葡萄糖氧化酶法
【实验原理】
葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和H2O2，H2O2在过氧化物酶（POD）催化下，将无色的色原4-氨基安替比林和苯酚氧化缩合生成红色的醌类化合物。
其颜色深浅在一定范围内与葡萄糖的含量成正比，与同样处理的标准管比较，即可求得标本中葡萄糖浓度。
其反应式如下。
【实验试剂】
1.0.1mol/LpH7.O磷酸盐缓冲液 取无水磷酸氢二钠8.67g，无水磷酸二氢钾5.3g溶解于约800ml蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或盐酸调pH至7.0，然后，用蒸馏水稀释至1L。
2.酶试剂 取GOD1200U（国际单位）POD1200U，4-氨基安替比林10mg，叠氮钠100mg，溶于上述磷酸盐缓冲液约70ml中，调pH至7.0，加磷酸盐缓冲液至100m1。
置冰箱保存，至少可稳定三个月。
3.酚试剂 称取酚100mg溶于100ml蒸馏水中（酚在空气中易氧化成红色，可先配成50g/dl的溶液，贮于棕色瓶中，用时稀释）。
4.酶酚混合试剂 临用前取酶试剂和酚试剂等量混合，置冰箱内可存放一个月。
5.12mmol/L苯甲酸溶液 取苯甲酸1.4g，加蒸馏水约900m1，加热助溶，冷却后加蒸馏水至1L。
6.100mmol/L葡萄糖标准贮存液 取无水葡萄糖置80℃烤箱内干燥恒重，移至干燥器内冷却后，准确称取1.802g用12mmol/L苯甲酸溶液溶解，移入100ml容量瓶中，再用12mmol/L苯甲酸溶液稀释至刻度，混匀，移入棕色瓶中，置冰箱内保存。
7.5mmol/L葡萄糖标准应用液 准确吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml于100ml容量瓶中，用12mmo1/L苯甲酸溶液稀释至刻度。
【操作步骤】
取试管3支，按表1-5-1操作。
表1-5-1 GOD-POD法葡萄糖测定操作表
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