生化检验技术实验.docx

1、生化检验技术实验生物化学检验2011级春季班检验实验室编实验一常用玻璃器皿的清洗及干燥【目的要求】学会常用玻璃器皿的清洗及干燥方法。【实验器材】1. 电热恒温干燥箱。2. 新购置的、日常用过的、被油脂类污染的以及假定被传染性标本污染过的容量瓶、刻度吸管、量筒、量杯、试管、烧杯若干；各种类型的大小毛刷若干。【实验试剂】1. 清洁液（重铬酸钾洗液） 称取重铬酸钾50g加蒸馏水50ml溶解后，将500ml浓硫酸缓缓加入上液中（切忌不可将重铬酸钾溶液倾入浓硫酸中），边加边用玻棒小心搅拌，以免产生高热而使容器破裂，配好放冷，装瓶加塞备用（防止浓硫酸吸水降低去污能力）。2. 2%盐酸溶液、2%次氯酸溶液。

2、3. 洗衣粉。【操作步骤】（一）洗涤1. 新购置的玻璃器皿都附有游离碱，应先置2%盐酸溶液中浸泡26小时，以除去游离碱。取出后用自来水冲洗后，置2%洗衣粉溶液中，用毛刷刷洗。取出再用自来水反复冲洗，最后，用蒸馏水淋洗23次即可。2. 日常用过的玻璃器皿先用自来水冲洗，再置2%洗衣粉溶液中用毛刷刷洗，自来水冲洗，最后，用蒸馏水淋洗23次即可。3. 不能用毛刷刷洗的器皿如容量瓶、刻度吸管等，可先用自来水冲洗沥干后，再用重铬酸钾洗液浸泡过夜，沥干洗液后用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗23次。4. 对传染性标本污染过的器皿，应先将其中所含试样倒入盛有2%次氯酸溶液的容器中，先用水冲洗后，浸泡在铬酸洗液中

3、过夜，再用自来水和蒸馏水冲洗。吸管、滴管类器皿用后应立即放在盛有消毒液（如过氧乙酸）的玻璃筒内浸泡，次日取出，流水冲洗，滤干后，浸泡在铬酸洗液中过夜，再用自来水和蒸馏水冲洗。5. 被石蜡、凡士林或其他油脂类污染的玻璃器皿要单独洗涤，洗涤前，首先去油脂（将器皿倒放于具有强吸水力的几层厚纸上，置100烤箱中烘烤半小时，使油脂熔化由厚纸吸收，再置碱性溶液中煮沸趁热洗刷，即可去除油脂），然后再按一般洗涤要求进行。（二）干燥1. 自然干燥 将洗净的不能用高温烘烤的器皿，如量筒、量杯、容量瓶、吸管等倒挂在晾架上，待其自然晾干。2. 烘烤干燥 除因高温使玻璃变形，改变容积，影响实验结果的玻璃量器外，其它玻璃

4、器皿如试管、烧杯、三角烧瓶等，均置于100120左右烤箱中烘烤干燥。【结果报告】【讨论分析】实验二吸收曲线绘制及721型分光光度计波长校正【目的要求】1. 了解可见光分光光度法在定性分析中的应用；2. 学习721型分光光度计的使用方法；3. 学会吸收曲线绘制及波长校正方法。【实验原理】光源通过棱镜色散成连续光谱，转动准直镜使色散光谱中某一部分由出光狭缝射出而成一单色光束，该光束的主波长由随同准直镜转动的波长刻度盘指示。刻度盘读数与出射光束实际波长是否相符，可通过测绘已知吸收峰波长的标准溶液或标准滤光片（如镨钕滤光片）的吸收曲线而确定。不同物质，由于其分子结构的差异，对光谱吸收的特性不同。吸光度

5、最大时的波长称为特征波长，以吸光度对波长所作的曲线叫吸收曲线（A-），吸收曲线可作为定性分析的理论依据。镨钕滤光片在可见光区内有许多固定不变的吸收峰，通常选择529nm的吸收峰（max为529nm时吸光度最大），如果偏离5292nm（超过允许误差波长）时应进行波长校正。【实验器材】721分光光度计（结构见图1-2-2），分光光度计配件镨钕滤光片、滤光片支架，白卡纸，螺丝刀，坐标纸。图1-2-2721型分光光度计结构1.光源室；2.电源变压器；3.稳压电路控制板；4.滤波电解电容5.光电管盒； 6.比色室；7.波长选择磨擦轮；8.单色光器组件9.“0”粗调电位器；10.读数表； 11.稳压电源功

6、率管一、吸收曲线绘制【操作步骤】1. 接通仪器电源，预热20分钟。2. 待仪器稳定后将镨钕滤光片（水红色）固定于滤光片支架，置于比色皿座上。转动波长调节旋钮，使波长刻度盘读数为520nm，以空气调零、调“T”旋钮至100%，将镨钕滤光片推向光路并记录吸光度值（每一波长重复测定3次）。3. 按表1-2-1中各波长，重复上述步骤（每次均须重新调零和调100%），记录数据。表1-2-1不同波长处镨钕滤片的吸光度(nm)A1A2A3(nm)A1A2A3520532522534524536526538528540530【结果处理】1. 取方格坐标纸，以波长为横坐标、吸光度为纵坐标（每1小格为0.01A）

7、建立直角坐标。2. 将不同波长处测得吸光度的平均值 按相应波长在坐标纸上标出。3. 连接各点，即可得到所测标准滤光片的吸收曲线。4. 观察指定吸收峰波长（实测值）与标度值是否相符，若不符合，即两者存在偏差。偏差值在2nm以内，波长误差在允许误差范围；偏差的绝对值2nm（超过允许误差），则应进行波长校正。二、波长校正【操作步骤】（一）粗调1. 接通仪器电源，预热20分钟。2. 选择开关置于“T”位，旋转波长至580nm。3. 将白卡纸放入比色室暗箱光电管一侧，转动光量旋钮，直至白卡纸上的光斑清晰可辩。观察光斑的形状应为边缘整齐、着色均匀的长方形，光斑呈黄色。4. 若光斑边缘不齐、着色不均应考虑调

8、整光源灯位置，若光斑呈色偏绿、偏红则说明波长不准。（二）精调1. 光源灯的更换和调整721分光光度计的光源灯采用12V 30W钨灯，更换钨灯时应先切断电源，然后用附件中的扳手旋松钨灯架上的两个紧固螺丝，取出损坏的钨灯，戴上手套，换上新钨灯后，将波长选择在580nm，开启主机电源开关，移动钨灯上、下、左、右位置，直到成像在入射狭缝上。观察光斑的形状应为边缘整齐、着色均匀的长方形，光斑呈黄色即可，最后将两颗紧固螺丝旋紧。2. 镨钕滤光片直接校正法该法操作简便易行。（1）接通仪器电源，预热20分钟；（2）将镨钕滤光片固定于滤光片支架，置于比色皿座内，旋转波长至528（或530）nm处，以空气调零、调

9、“T”旋钮至100%；（3）用螺丝刀卸下仪器侧面板上的四颗固定螺丝，按说明书指示找准波长调节螺杆；（4）手握螺丝刀，缓慢转动波长调节螺杆，同时观察读数表盘上吸光度变化（吸光度下降应反向转动）直至调至最大（透光度则为最小）为止；（5）读取特征波长附近各10nm（间隔2nm测定一次）的吸光度值验证无误后，上好侧面板。【结果报告】【讨论分析】实验三缓冲液离子强度对电泳速度的影响【目的要求】1. 学习电泳的一般原理和方法，初步掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离蛋白质技术；2. 观察并比较不同缓冲液离子强度（I）对电泳速度的影响。【实验原理】根据Stoke定律，带电颗粒在电场中，受电场力作用向着电性相反方向移动

10、的速度，与颗粒所带电荷量与电场强度乘积成正比，与颗粒半径成反比。同种物质在电场强度、电泳时间、缓冲液pH相同条件下，电泳迁移率与缓冲液离子强度成反比。【实验器材】1. 实验器材 新鲜人血清，醋酸纤维素薄膜（CAM），滤纸，竹镊子，血清加样器。2. 仪器 电泳仪（0300V，050A），普通电泳槽。【实验试剂】1. 巴比妥盐缓冲液(1)巴比妥盐缓冲液（pH8.6，离子强度0.06）称取巴比妥钠（C8Hl1O3N2Na） 12.76g、巴比妥（C8H12O3N2）1.66g，加蒸馏水约500m1加热溶解，待冷至室温，用蒸馏水加到1L。(2)巴比妥盐缓冲液（pH8.6，离子强度0.03）取(1)液用

11、蒸馏水稀释一倍即成。2. 氨基黑10 B染色液称取氨基黑10 B 0.5g，加冰醋酸10ml，甲醇50ml，充分研磨溶解后用蒸馏水补足到100ml。3. 漂洗液甲醇（或乙醇）45ml，加冰醋酸5m1，蒸馏水补足到100ml。【操作步骤】1. 薄膜准备 将醋酸纤维素薄膜裁成28cm大小，在膜的粗面上距膜一端1.52.0cm处用铅笔轻轻划一条点样线，标明编号；将薄膜分别置于离子强度0.06和离子强度0.03的缓冲液中，大约20分钟，浸透为止。加样前取出，用滤纸吸去表面多余的缓冲液。2. 点样 用血清加样器沾取血清少许，垂直印在醋酸纤维素薄膜点样线上，立即将醋酸纤维素薄膜分别放入相应离子强度的电泳槽

12、支架上，用滤纸作盐桥与缓冲液相通，注意将点样面朝下，点样端置于阴极端。3. 平衡 盖上电泳槽盖，使醋酸纤维素薄膜通过滤纸桥吸足缓冲液约5分钟。4. 电泳 电压100150V，电流0.40.6A/cm宽。通电约4050分钟，待白蛋白移动距离约23cm时，记录电泳时的电压、电泳时间，关闭电源，测量支持介质的有效长度。5. 染色 取出薄膜，可直接浸入染色液中，染23分钟后取出，再用漂洗液漂洗数次，直到背景干净为止。【结果分析】1. 利用所记录的电泳电压（V）、支持物有效长度（l，单位为cm）、电泳时间（，单位为s）和白蛋白移动的距离（，单位为cm），分别计算用离子强度0.03和0.06的白蛋白的迁移

13、率，判断离子强度对电泳速度的影响。迁移率计算公式如下：(cm2.V-1.s-1)图1-3-1血清蛋白CAM电泳图谱2. 比较离子强度0.03和0.06的缓冲液的电泳图形，判断在哪种离子强度下进行蛋白质电泳较好。血清蛋白CAM电泳图谱如图1-3-1。3. 观察CAM电泳可将血清蛋白质分成几种成分？各成分的区带位置及相对含量高低。【结果报告】【讨论分析】实验四血糖测定一、葡萄糖氧化酶法【实验原理】葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和H2O2，H2O2在过氧化物酶（POD）催化下，将无色的色原4-氨基安替比林和苯酚氧化缩合生成红色的醌类化合物。其颜色深浅在一定范围内与葡萄糖的含量成正比

14、，与同样处理的标准管比较，即可求得标本中葡萄糖浓度。其反应式如下。【实验试剂】1. 0.1mol/L pH7.O磷酸盐缓冲液取无水磷酸氢二钠8.67g，无水磷酸二氢钾5.3g溶解于约800ml蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或盐酸调pH至7.0，然后，用蒸馏水稀释至1L。2. 酶试剂取GOD 1 200U（国际单位）POD 1 200U，4-氨基安替比林10mg，叠氮钠100mg，溶于上述磷酸盐缓冲液约70ml中，调pH至7.0，加磷酸盐缓冲液至100m1。置冰箱保存，至少可稳定三个月。3. 酚试剂称取酚100mg溶于100ml蒸馏水中（酚在空气中易氧化成红色，可先配成50g/dl的溶液，贮于

15、棕色瓶中，用时稀释）。4. 酶酚混合试剂临用前取酶试剂和酚试剂等量混合，置冰箱内可存放一个月。5. 12mmol/L苯甲酸溶液取苯甲酸1.4g，加蒸馏水约900m1，加热助溶，冷却后加蒸馏水至1L。6. 100mmol/L葡萄糖标准贮存液取无水葡萄糖置80烤箱内干燥恒重，移至干燥器内冷却后，准确称取1.802g用12mmol/L苯甲酸溶液溶解，移入100ml容量瓶中，再用12mmol/L苯甲酸溶液稀释至刻度，混匀，移入棕色瓶中，置冰箱内保存。7. 5mmol/L葡萄糖标准应用液准确吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml于100ml容量瓶中，用12mmo1/L苯甲酸溶液稀释至刻度。【操作步骤】取试管3支，按表1-5-1操作。表1-5-1GOD-POD法葡萄糖测定操作表加入物