肠道微生物的分离与鉴定方法Word格式文档下载.docx
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2到3个略高于液面的青霉素小瓶，再按比例称取焦性没食子酸用纸
包好，放在圆柱上。
继而放上隔板，将接种完毕的培养基放于隔板上，同时放
美蓝指示剂一管。
盖上缸盖并用石蜡封闭。
再轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸掉人氢氧化钠液中，反应后，干燥器内无氧，美蓝指示剂由蓝变白。
置于温箱37c培养24—48h观察结果。
2、方法来自文献《健康猪肠道菌群的分离培养与耐药性分析》
后者先拧紧瓶盖，放入密封性较好的玻璃罐（用凡士林封口），通过蜡烛燃烧法制作简易厌氧装置。
五、CO2培养箱不可代替无氧培养箱
厌氧箱一般是组合气体90%氮气+5%氢气+5%二氧化碳，厌氧箱里面培养的微生物都是厌氧微生物；
而二氧化碳培养箱里面是5%二氧化碳+95%空气，里面是有一部分氧气的。
一般的研究认为严格厌氧菌的培养环境中02的浓度必须小于WOOPpm（千分之一），更严格的环境是小于300Ppm（万分之三），本实验室C02培养箱C02浓度范围为280-2000ppm,所以CO2培养箱是不能用来培养严格厌氧菌。
（1ppm即百万分之一）。
目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：
厌氧箱培养技
术；
厌氧罐培养技术；
厌氧袋培养技术；
1.一般性的细菌培养标本若需延迟送检时，应置于4度冰箱保存，且不能超过24小时。
2.临床标本最佳运送时间取决于标本的量，少量液体（小于1ml）或组织
（小于1cni3）应在15~30分钟内送到实验室，较多量的标本置于运送培养基中可放12~24小时，厌氧培养标本原则上是床边接种，如延迟送检，需保存在厌氧运送培养基中，室温保存，不得超过24小时。
低温对一些厌氧菌有害。
1•采样和运输：
同时间、同地点、同位置分别取两管平行粪样，可适量多取，一
管做需氧菌分离和提纯，另一管做厌氧菌的分离和提纯；
需氧菌按原方案用冰块运输，厌氧菌放置于厌氧生物袋常温运输（一般认为，低温对某些厌氧菌有害，并且氧的溶解度较高）。
2.保存：
标本送至实验室后，应尽快处理，最迟不超过24h«
需氧菌放置于4c
冰箱保存，厌氧菌放置于常温保存。
3.分离、纯化：
需氧菌按原计划进行。
厌氧菌培养基中添加万分之五的半胱氨酸
或硫化钠做还原剂，消除培养皿内部氧气。
1.一般性的细菌培养标本若需延迟送检时，应置于4度冰箱保存，且不能超过24小时。
2.临床标本最佳运送时间取决于标本的量，少量液体（小于1ml）或组织（小于1cni3）应在15~30分钟内送到实验室，较多量的标本置于运送培养基中可放12~24小时，厌氧培养标本原则上是床边接种，如延迟送检，需保存在厌氧运送培养基中，室温保存，不得超过24小时。
研
培
究
养
微生
位样
培养
皿
物种
文献名称置品培养基种类
条件培养时间
度
类
检测
菌株
包括:
双歧
杆菌,
拟杆
菌，
优杆菌，消化
胃肠道菌
胃
性球
群和胃肠
肠需
黏膜屏障
道粪选择性培养基，具体
氧，
乳杆
的检测
菌便不详
厌氧24-72h
菌及
肠杆
肠球菌，
葡萄
球
及酵
母
菌O
10种
乳酸
贵州小型菌，
猪胃肠道拟杆
正常菌群肠10种菌的选择性培养需需氧菌，
的初步检道粪基和需氧、厌氧的非氧，菌:
24-48h庆消化
菌便选择性培养基
厌氧氧菌：
48-72h37cC球
荣球菌梭菌肠杆菌肠球菌葡萄球菌。
酵■母；
菌£
10
°
C母7孝
3酉
油肉汤浸液琼脂，EC
11
I厌氧24-48h
34-uJJJ粪培养禎验用
芽抱
杆
菌。
5种大肠杆菌，乳酸杆
菌,
健康猪肠道菌群的
分离培养肠麦康凯琼脂，MRS增需
与耐药性道粪菌液，HYA琼脂，TYP氧，需氧菌:
24h,菌。
3
健康与腹
普通和SS琼脂培养
大肠
泻幼犬肠
基，甘油肉汤浸液琼
道菌群数
肠脂培养基，MRS乳酸需
量差异分
道粪菌、EC肠球菌、EMB氧，
沙门
分析菌便琼脂
厌氧厌氧菌：
48h37°
C种
菌选择培养基，麦康菌，
凯培养基，生化试验肠球
用培养基菌，
乳酸杆菌，双歧杆菌。
5种芽抱杆菌，乳酸杆菌，双歧杆菌，
MRS培养基，营养琼大肠
健康鸽与脂平板，双歧杆菌培杆菌,
腹泻鸽肠肠取养基，麦康凯培养基，需肠球
道菌群比道肠EC培养基，生化试验氧，菌。
5
较研究菌道培养基厌氧24-72h37c种
乳酸杆菌
便匹罗星锂盐改良MRS
的分离与培养基，营养肉汤培
鉴定养基，
生化试验培养
嗜酸
基
性乳
酸杆
干酪
种
嗜热
脂肪
猪源益生
地衣
芽抱杆菌
芽孑包
的分离鉴
LB培养基，淀粉培养
定与生物
基，酪素培养基，竣需
学特性分
粪甲基纤维素钠培养
氧,
枯草
3种
厌氧菌的培养方法
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。
要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。
通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。
如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。
常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1.厌氧缸法：
接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧坏境，从而将厌氧菌培养出来。
2.厌氧袋：
即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。
塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钳催化剂管、干燥剂。
放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。
先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。
如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。
3.厌氧手套箱：
是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。
它
是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。
箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。
欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。
箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钳的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。
该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。
金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
4.厌氧盒：
原理同厌氧袋，有成品销售。
5.生物耗氧法：
在一密闭的容器内放以生物，消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。
我没见过。
6.焦性末食子酸法：
在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHC03粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。
焦性末食子酸与碱反应后耗氧。
该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。
如有梭状芽抱杆菌。
7.疱肉培养基：
本身就是一个不需特殊设备的厌氧培养法。
疱肉和肉汤装入大试管，液面封凡士林，造成无氧环境。
厌氧菌标本的采集与送检
厌氧菌标本采集与送检必须注意两点：
标本绝对不能被正常菌群所污染；
应尽量避免接触空气。
1.采集：
采集标本须注意：
不被正常菌群污染，并尽量避免接触空气。
采集深部组织标本时，需用碘酒消毒皮肤用注射器抽取，穿刺针头应准确插入病变部位深部,抽取数毫升即可，抽出后可排出一滴标本于酒精棉球上。
若病灶处标本量较少,则可先用注射器吸取1ml还原性溶液或还原性肉汤，然后再抽取标本。
在紧急情况下，可用棉拭取材，并用适合的培养基转送。
厌氧培养最理想的检查材料是组织标本，因厌氧菌在组织中比在渗出物中更易生长医。
用于厌氧菌培养的标本不同于一般的细菌培养，多采用特殊的采集方法，如针筒抽取等，应严格无菌操作，严禁接触空气。
不同部位标本采集方法也各有不同特点
2.送检方法与处理
标本送到实验室后，应在20-30min内处理完毕，最迟不超过2
h,以防止标本中兼性厌氧菌过度繁殖而抑制厌氧菌的生长。
如不能及时接种，可将标本置室温保存（一般认为，冷藏对某些厌氧菌有害，而且在低温时氧的溶解度较高）。
1）针筒运送：
一般用无菌针筒抽取标本后，排尽空气，针头插入无菌橡皮
塞，以隔绝空气，立即送检。
这种方法多用于液体标本的运送，如血液、脓液、胸腹水、关节液等医.
2）无菌小瓶运送：
一般采用无菌的青霉素小瓶，瓶内加一定量的培养基和少量氧化还原指示剂，用橡皮盖加铝盖固定密封，排除瓶内空气，充以C02气体。
同时先观察瓶内氧化还原指示剂的颜色，以判断瓶内是否为无氧环境，如合格将用无菌注射器将液体标本注入瓶中即可。
3）棉拭子运送一般不采用棉拭子运送，如果使用该方法，一定使用特制运送培养基，确保无氧环境，确保不被污染，确保快速送检。
4）厌氧罐或厌氧袋运送将厌氧罐或厌氧袋内装入可有效消耗氧气的物质,确保无氧环境。
该方法一般用于运送较大的组织块或床边接种的培养皿等。
厌氧菌的分离鉴定及注意事项
厌氧菌广泛存在于外界环境和人体的口腔、肠道和女性生殖道等部位，常引起内源性感染。
据文献报道，约60%的临床感染有厌氧菌参与，且大多数是与需氧菌混合感染，故开展厌氧菌的检验对感染的诊断、治疗都有重要意义。
、厌氧菌样品的采集CoIIectionofanaerobicbacteria'
sspecimens
标本避免正常菌群污染和氧接触，采用下列方法：
（1）脓胸及未破溃的脓肿：
皮肤消毒后,
以无菌注射器抽取（排
尽空针及针头内的气体），将针头插入无菌橡皮塞内送检。
（2）肺分泌物和痰标本:
用支气刷采取或环甲膜穿刺术。
（3）尿液标本：
用无菌注射器从耻骨上缘行膀脱穿刺术抽取。
（4）血液标本：
可用两端接有无菌针头的塑料袋或橡皮导管，将一端针头刺入静脉，待血液流出后将另一端针头立即插入培养瓶内（瓶内负压），使血液直接流入培养瓶内。
（5）窦道、深部脓肿等的标本：
可用特别采样器采取。
、涂片与染色Smearpreparationandstain
标本涂片、革兰染色、镜检，观察细菌的形态和染色性，并估计
标本中大致的含菌量，可用”少量"
”、“++”、“+++“、”++
++”表示。
镜检不仅能反映各种厌氧菌的特殊形态，同时也能为鉴定
厌氧菌提供参考和依据。
如脆弱拟杆菌菌体细长，两端尖：
韦荣球菌是极小的革兰阴性球菌。
厌氧菌芽胞的位置、形态、大小对鉴定很有意义，必要时作芽胞形成试验。
例如，芽胞在菌体极端且大于菌体呈鼓槌状，是破伤风梭菌的特征。
根据厌氧菌的特殊形态，可初步确定有无厌氧菌感染，及时向临床医师发出一级报告，建议采用哪类药物。
三、标本接种InocuIating
一般标本接种3个血琼脂平板，分别放置于有氧、无氧和含5%
10%C02的环境中培养。
如果只要求检出厌氧菌，只需接种
个厌氧血琼脂平板，也可增加1个相应的选择厌氧血琼脂平板。
为便于在混合培养中及早发现厌氧菌，一般将标本分3段划线接种，在第1和第2段交界处贴1张甲硝哗（5mg/片）纸片，若出现隐约抑菌圈，则提示有厌氧菌生长。
不同厌氧菌的生长速度和菌落形态各异，色素也有不同，荧光产
生与否也有助于鉴定，根据上述特征，可初步推测厌氧菌的种类：
1.革兰阴性杆菌
（1）在BBE琼脂平板上有灰黑色、直径〉1mm的菌落，菌落周围有黑色的晕，可初步鉴定为脆弱拟杆菌。
（2）在卡那万古溶血琼脂平板上，有棕色或黑色菌落，或用伍德灯照射有被红色荧光者，为产黑素普雷沃菌。
（3）菌落沉入琼脂内，使培养基表面留有小坑者，可能是解月尿拟杆菌和纤细拟杆菌。
（4）菌落表面有小斑点，或如面包屑，结合涂片所见，可初步鉴定为具核梭杆菌。
2.革兰阴性球菌菌体很小，排列成双、短链或小堆，菌落小，不透明，可能是小韦荣球菌。
3.革兰阳性球菌排列成长短不等的链，可能是消化链球菌。
4.苹兰阳性无芽胞杆菌
（1）菌落呈臼齿形、粗糙，结核脓样分泌物中有硫黄样颗粒，可能是放线菌。
（2）菌体呈X、Y、V排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸杆菌。
5.革兰阳性芽胞杆菌只要见有芽胞，即可鉴定为梭菌属。
菌落有双环溶血，卵黄平皿上卵磷脂酶试验和Nagier试验阳性，涂片染色为革兰阳性短粗杆菌，有芽胞，有荚膜，可鉴定为产气荚膜梭菌。
四、耐氧试验OxygentoIeraneetest
当厌氧平板上有细菌生长时，为了确定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。
从每个琼脂平板上挑取4~5个性状不同的菌落，每个菌落分别转种于2块需氧血琼脂平板和1块厌氧血琼脂平板（每个琼脂平板可划4~6区，每区种一个可疑菌落），然后将平板分别放置在需氧、二氧化碳和厌氧坏境中培养。
凡在厌氧环境生长，而在需氧和二氧化碳环境中不生长的细菌为专性厌氧菌；
在需氧和厌氧环境中均能生长者为兼性厌氧菌；
在需氧和二氧化碳环境中生长，而在厌氧环境中不生长者为专性需氧菌；
在需
氧、厌氧环境中均不生长或生长不佳，而在二氧化碳环境中生长良好的细菌为需二氧化碳菌。
五、鉴定试验Identificationtest
可依据厌氧菌的菌体染色形态、菌落特性以及对某些抗生素的敏感性作出
初步鉴定。
最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等检查。
生化试验主要包括多种糖类发酵试验、呻噪试验、硝酸盐还原试
验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂酶试验、明胶液化试验及胆汁肉汤生长试验和硫化氢试验等。
目前用于厌氧菌快速鉴定有胞外酶试验，
4h即可观察结果；
自动微生物鉴定系统，如VITEK-ANI、MicroScan-ANI等也可鉴定厌氧细菌。
在进行厌氧菌分离鉴定的过程中，需注意下列事项
1厌氧菌标本在采集和运输的过程中必须与空气隔绝（厌氧菌暴露于空
气中时间太长可死亡），务必在30min内完成，同时应避免正常菌群的污染。
2培养基要新鲜配制，若储存太久，有氧气溶解在表面或有过氧化物在培养基中，不利于厌氧菌生长。
3若菌落太小，需用放大镜观察菌落。
4作耐氧试验，要求从每个琼脂平板上挑取4~5个性状不同的菌落，分别接种需氧和厌氧血琼脂平板，置于需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。
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