肠道微生物的分离与鉴定方法Word格式文档下载.docx

1、2到3个略高于液面的青霉素小瓶，再按比例称取焦性没食子酸用纸包好，放在圆柱上。继而放上隔板，将接种完毕的培养基放于隔板上，同时放美蓝指示剂一管。盖上缸盖并用石蜡封闭。再轻轻摇动干燥器，使焦性没食子 酸掉人氢氧化钠液中，反应后，干燥器内无氧，美蓝指示剂由蓝变白。置于温 箱37c培养24 48h观察结果。2、方法来自文献健康猪肠道菌群的分离培养与耐药性分析后者先拧紧瓶盖，放入密封性较好的玻璃罐（用凡士林封口），通过蜡烛燃烧 法制作简易厌氧装置。五、CO 2培养箱不可代替无氧培养箱厌氧箱一般是组合气体90%氮气+5%氢气+5%二氧化碳，厌氧箱里面培养的微生 物都是厌氧微生物；而二氧化碳培养箱里面是5

2、%二氧化碳+95%空气，里面是有 一部分氧气的。一般的研究认为严格厌氧菌的培养环境中02的浓度必须小于 WOOPpm （千分之一），更严格的环境是小于300Ppm （万分之三），本实验 室C02培养箱C02浓度范围为280-2000ppm,所以CO2培养箱是不能用来培养严 格厌氧菌。（1ppm即百万分之一）。目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有： 厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；1. 一般性的细菌培养标本若需延迟送检时，应置于4度冰箱保存，且 不能超过 24小时。2.临床标本最佳运送时间取决于标本的量，少量液体（小于1ml） 或组织（小于1cni3）应在1530分钟内送

3、到实验室，较多量的标本置于运送培养基中 可放1224小时，厌氧培养标本原则上是床边接种，如延迟送检，需保存在厌 氧运送培养基中，室温保存，不得超过24小时。低温对一些厌氧菌有害。1采样和运输：同时间、同地点、同位置分别取两管平行粪样，可适量多取，一管做需氧菌分离和提纯，另一管做厌氧菌的分离和提纯；需氧菌按原方案用冰 块运输，厌氧菌放置于厌氧生物袋常温运输（一般认为，低温对某些厌氧菌有 害，并且氧的溶解度较高）。2.保存：标本送至实验室后，应尽快处理，最迟不超过24h需氧菌放置于4c冰箱保存，厌氧菌放置于常温保存。3.分离、纯化：需氧菌按原计划进行。厌氧菌培养基中添加万分之五的半胱氨酸或硫化钠做

4、还原剂，消除培养皿内部氧气。1 . 一般性的细菌培养标本若需延迟送检时，应置于4度冰箱保存，且不能超过 24小时。2 .临床标本最佳运送时间取决于标本的量，少量液体（小于1ml） 或组织 （小于1cni3）应在1530分钟内送到实验室，较多量的标本置于运送培养基中 可放1224小时，厌氧培养标本原则上是床边接种，如延迟送检，需保存在厌 氧运送培养基中，室温保存，不得超过24小时。研培究养微生位样培养皿物种文献名称 置品培养基种类条件培养时间度类检测菌株包括:双歧杆菌,拟杆菌，优杆 菌， 消化胃肠道菌胃性球群和胃肠肠需黏膜屏障道粪选择性培养基，具体氧，乳杆的检测菌便不详厌氧24-72h菌及肠杆肠

5、球 菌，葡萄球及酵母菌O10种乳酸贵州小型 菌，猪胃肠道 拟杆正常菌群 肠10种菌的选择性培养 需需氧 菌，的初步检道粪基和需氧、厌氧的非氧，菌:24-48h庆 消化菌便选择性培养基厌氧氧菌：48-72h 37cC球荣 球 菌 梭 菌 肠 杆 菌 肠球 菌 葡 萄球菌。酵 母；菌10C母 7孝3酉油肉汤浸液琼脂， EC1 1I 厌氧 24-48h34- u JJJ 粪培养禎验用芽抱杆菌。5种 大肠 杆 菌， 乳酸 杆菌,健康猪肠 道菌群的分离培养 肠麦康凯琼脂， MRS增需与耐药性 道 粪 菌液，HYA琼脂，TYP氧，需氧菌:24h,菌。3健康与腹普通和SS琼脂培养大肠泻幼犬肠基，甘油肉汤浸液

6、琼道菌群数肠脂培养基， MRS乳酸需量差异分道粪菌、EC肠球菌、EMB氧，沙门分析 菌便琼脂厌氧厌氧菌：48h 37C种菌选择培养基，麦康 菌，凯培养基，生化试验 肠球用培养基 菌，乳酸 杆 菌， 双歧 杆 菌。5 种 芽抱 杆菌， 乳酸 杆菌， 双歧 杆菌，MRS培养基，营养琼 大肠健康鸽与 脂平板，双歧杆菌培 杆菌,腹泻鸽肠 肠取养基，麦康凯培养基，需 肠球道菌群比道肠EC培养基，生化试验 氧， 菌。5较研究菌道培养基 厌氧24-72h 37c种乳酸杆菌便匹罗星锂盐改良 MRS的分离与培养基，营养肉汤培鉴定养基，生化试验培养嗜酸基性乳酸杆干酪种嗜热脂肪猪源益生地衣芽抱杆菌芽孑包的分离鉴LB

7、培养基，淀粉培养定与生物基，酪素培养基，竣 需学特性分粪甲基纤维素钠培养氧,枯草3 种厌氧菌的培养方法厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环 境。通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以 降低氧化还原电势。如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。 常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培 养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧坏境，从而将 厌氧菌培养出来。2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不 透气，内装气体发生管、美

8、兰指示剂管、钳催化剂管、干燥剂。放入已接种好 的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美 兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧 状态，可以孵育。3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有 两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二 门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进 行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入 箱内，关上内门。箱内保 持厌氧状态，也是利用充气中的氢

9、在钳的催化下和箱 中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其 内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的 大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌 氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物，消耗氧气，同时产生二氧 化碳，供细菌生长用。我没见过。6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒 上焦性 末食子酸，然后再混入NaHC03粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒 扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。

10、焦性末食子酸与碱反应后 耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽抱杆菌。7.疱肉培养基：本身就是一个不需特殊设备的厌氧培养法。疱肉 和肉汤装入大试管，液面封凡士林，造成无氧环境。厌氧菌标本的采集与送检厌氧菌标本采集与送检必须注意两点：标本绝对不能被正常菌群 所污染； 应尽量避免接触空气。1.采集：采集标本须注意：不被正常菌群污染，并尽量避免接触空气。采集深部组织 标本时，需用碘酒消毒皮肤用注射器抽取，穿刺针头应准 确插入病变部位深部, 抽取数毫升即可，抽出后可排出一滴标本于酒精棉球上。若病灶处标本量较少, 则可先用注射器吸取1ml还原性溶液或还原性肉汤，然后再抽取标本。在紧急情

11、 况下，可用棉拭取材，并用适合的培养基转送。厌氧培养最理想的检查材料是 组织标本，因厌氧菌在组织中比在渗出物中更易生长医。用于厌氧菌培养的标本不同于一般的细菌培养，多采用特殊的采集方法， 如针筒抽取等，应严格无菌操作，严禁接触空气。不同部位标本采集方法也各有不同特点2.送检方法与处理标本送到实验室后，应在20-30m i n内处理完毕，最迟不超过2h,以防止标本中兼性厌氧菌过度繁殖而抑制厌氧菌的生长。如不能及时接种， 可将标本置室温保存（一般认为，冷藏对某些厌氧菌有害，而且在低温时氧的溶 解度较高）。1）针筒运送：一般用无菌针筒抽取标本后，排尽空气，针头插入无菌橡皮塞，以隔绝空气，立即送检。这

12、种方法多用于液体标本的运 送，如血液、脓液、 胸腹水、关节液等医.2） 无菌小瓶运送：一般采用无菌的青霉素小瓶，瓶内加一定量的培养基和 少量氧化还原指示剂，用橡皮盖加铝盖固定密封，排除瓶内空气，充以C02气体。 同时先观察瓶内氧化还原指示剂的颜色，以判断瓶内是否为无氧环境，如合格将 用无菌注射器将液体标本注入瓶中即可。3） 棉拭子运送一般不采用棉拭子运送，如果使用该方法，一定使用特制运 送培养基，确保无氧环境，确保不被污染，确保快速送检。4） 厌氧罐或厌氧袋运送将厌氧罐或厌氧袋内装入可有效消耗氧气的物质, 确保无氧环境。该方法一般用于运送较大的组织块或床边接种的培养皿等。厌氧菌的分离鉴定及注意

13、事项厌氧菌广泛存在于外界环境和人体的口腔、肠道和女性生殖道等 部位，常 引起内源性感染。据文献报道，约60 %的临床感染有厌氧菌参与，且大多数是 与需氧菌混合感染，故开展厌氧菌的检验对感染的诊断、治疗都有重要意义。 、厌氧菌样品的采集 Co I I ect i on of anaerob i c bacter i a s spec i mens标本避免正常菌群污染和氧接触，采用下列方法：（1）脓胸及未破溃的脓肿：皮肤消毒后,以无菌注射器抽取（排尽空针及针头内的气体），将针头插入无菌橡皮塞内送检。（2）肺分泌物和痰标本:用支气刷采取或环甲膜穿刺术。（3）尿液标本：用无菌注射器从耻骨上缘行膀脱穿刺

14、术抽取。（4）血液标本：可用两端接有无菌针头的塑料袋或橡皮导管，将一端针头刺 入静脉，待血液流出后将另一端针头立即插入培养瓶内（瓶内负压），使血液直接 流入培养瓶内。（5）窦道、深部脓肿等的标本：可用特别采样器采取。、涂片与染色 Smear preparation and stain标本涂片、革兰染色、镜检，观察细菌的形态和染色性，并估计标本中大致的含菌量，可用”少量”、“ +”、“+ +“、” + ”表示。镜检不仅能反映各种厌氧菌的特殊形态， 同时也能为鉴定厌氧菌提供参考和依据。如脆弱拟杆菌菌体细长，两端尖：韦荣球菌是极小的革 兰阴性球菌。厌氧菌芽胞的位置、形态、大小对鉴定很有意义，必要时作

15、芽胞形 成试验。例如，芽胞在菌体极端且大于菌体呈鼓槌状，是破伤风梭菌的特征。根 据厌氧菌的特殊形态，可初步确定有无厌氧菌感染，及时向临床医师发出一级报 告，建议采用哪类药物。三、标本接种I nocu I at i ng一般标本接种3个血琼脂平板，分别放置于有氧、无氧和含5 %10 % C02的环境中培养。如果只要求检出厌氧菌，只需接种个厌氧血琼脂平板，也可增加1个相应的选择厌氧血琼脂平板。为便于在混合培 养中及早发现厌氧菌，一般将标本分3段划线接种，在第1和第2段交界处贴 1张甲硝哗（5 mg/片）纸片，若出现隐约抑菌圈，则提示有厌氧菌生长。不同厌氧菌的生长速度和菌落形态各异， 色素也有不同，

16、荧光产生与否也有助于鉴定，根据上述特征，可初步推测厌氧菌的种类：1.革兰阴性杆菌（1）在BBE琼脂平板上有灰黑色、直径1mm的菌落，菌落周围有黑色的 晕，可初步鉴定为脆弱拟杆菌。（2）在卡那万古溶血琼脂平板上，有棕色或黑色菌落，或用伍德灯照射有被 红色荧光者，为产黑素普雷沃菌。（3）菌落沉入琼脂内，使培养基表面留有小坑者，可能是解月尿拟杆菌和纤 细拟杆菌。（4）菌落表面有小斑点，或如面包屑，结合涂片所见，可初步鉴定为具核梭 杆菌。2.革兰阴性球菌菌体很小，排列成双、短链或小堆，菌落小，不透明，可 能是小韦荣球菌。3.革兰阳性球菌排列成长短不等的链，可能是消化链球菌。4.苹兰阳性无芽胞杆菌（1）

17、菌落呈臼齿形、粗糙，结核脓样分泌物中有硫黄样颗粒，可能是放线菌。（2）菌体呈X、Y、V排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸杆菌。5 .革兰阳性芽胞杆菌只要见有芽胞，即可鉴定为梭菌属。菌落有双环溶 血，卵黄平皿上卵磷脂酶试验和Nagi er试验阳性，涂片染色为革兰阳性短粗杆 菌，有芽胞，有荚膜，可鉴定为产气荚膜梭菌。四、 耐氧试验 Oxygen to I era nee test当厌氧平板上有细菌生长时，为了确定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。从 每个琼脂平板上挑取45个性状不同的菌落，每个菌落 分别转种于2块需氧血 琼脂平板和1块厌氧血琼脂平板（每个琼脂平板可划46区，每区种一个可疑菌 落），

18、然后将平板分别放置在需氧、二氧化碳和厌氧坏境中培养。凡在厌氧环境生长，而在需氧和二氧化碳环境中不生长的细菌为专性厌氧 菌；在需氧和厌氧环境中均能生长者为兼性厌氧菌；在需氧和二氧化碳环境中生 长，而在厌氧环境中不生长者为专性需氧菌 ；在需氧、厌氧环境中均不生长或生长不佳，而在二氧化碳环境中生长良好 的细菌为 需二氧化碳菌。五、 鉴定试验 I dent i f i cat i on test可依据厌氧菌的菌体染色形态、菌落特性以及对某些抗生素的敏感性作出初步鉴定。最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等检查。生化试验主要包括多种糖类发酵试验、 呻噪试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂酶

19、试验、明胶液化试验及胆汁肉汤 生长试验 和硫化氢试验等。目前用于厌氧菌快速鉴定有胞外酶试验，4h即可观察结果；自动微生物鉴定系统，如VITEK-ANI、MicroS can- AN I 等也可鉴定厌氧细菌。在进行厌氧菌分离鉴定的过程中，需注意下列事项1厌氧菌标本在采集和运输的过程中必须与空气隔绝（厌氧菌暴露于空气中时间太长可死亡），务必在30 min内完成，同时应避免正常菌群的污染。2培养基要新鲜配制，若储存太久，有氧气溶解在表面或有过氧化物在培养 基中，不利于厌氧菌生长。3若菌落太小，需用放大镜观察菌落。4作耐氧试验，要求从每个琼脂平板上挑取4 5个性状不同的菌落，分 别接种需氧和厌氧血琼脂平板，置于需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。