表征生物药物的分析工具以及对生物仿制药的启示Word文档下载推荐.docx
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凭借政府监管人员手中握有设定这一标准的权利（再加上越来越多商业上成功的生物制品的专利保护近来或即将到期），全球的监管机构正在为引进生物仿制药建立途径，目的是为了实现最终想要获得的益处。
在欧洲，欧洲药品管理局（EMA）于2005年引进了第一个运行框架，旨在为生物仿制药的开发和上市开辟通道。
自此，欧洲生物仿制药指导方针描绘完成（参看EMA网站），13种生物仿制药已经获批并依然存在在市场上。
在美国，2009年的生物制品价格竞争和创新法案授予美国食品药品管理局（FDA）在美国境内建立一条途径以引进生物仿制药的权利，该指导方针草案于2012年2月9日颁布（参看FDA网站，参考资料1，2）。
在起草这份草案时，FDA发起了一场听证会，该听证会于2010年进行，旨在从风险涉众处获取关于生物仿制药四个主要方面的意见：
第一，管理局应该考虑什么科学和技术因素以确定生物产品与对照品是高度相似的（尽管在临床无活性组分上有小的差异）？
第二，管理局应该考虑什么科学和技术因素以确定适合的分析、动物和临床试验（或多次临床试验）来评估被提议的生物仿制药产品及其对照品之间实际或者潜在的结构差异的本质和影响？
第三，如果申请人可以证明被提议的生物仿制药产品和对照品之间不存在任何临床上有显著意义的差异，被提议的生物仿制药产品和对照品之间什么范围的结构差异是与"
高度相似"
这一标准一致的并且是351（k）申请可以接受的？
第四，在什么情况下管理局应当考虑提交351（k）申请时动物试验或临床试验（或多次临床试验）是不必要的？
依照FDA的观点，治疗蛋白的三种性质（与这些方面中的几个相关）虽不能得到充分测量但被认为对理解蛋白质药物的行为是重要的：
考虑到存在快速促进我们检测这三种性质的能力的需求，现在正是回顾目前可行的用于产生关于这些特性的数据的分析方法的时候，在本文中我们依照FDA和EMA发布的指南对此进行了讨论。
然而，在考虑这三个已被鉴定为能促进分析的主要方面之前，重要的是讨论一下在评估可比性方面一些普遍的挑战。
评估可比性的普遍挑战
评估生物制品可比性时的第一个挑战是正确理解"
可比的"
，"
相似的"
和"
高度相似的"
词的含义。
在开发创新生物制品时，生产过程通常经历无数次改变（由于各种各样的原因），有时甚至在药物商品化以后还会发生改变。
结果，创新者为了能将这些改变后的药物用于任何接下来的临床试验或已经商业化许可的产品，需要进行可比试验以向监管人员显示药物产品在流程改变前后是"
相当的"
。
在此，我们将这类比较称为内部比较。
开发一种原研生物制品的仿制药版本时，生物仿制药的生产者必需执行一项更具挑战性的任务以证明其生物仿制药与原研药相比是"
（EMA用语）或"
（FDA用语）。
在此，我们将这类比较性称为外部比较。
应该注意到可比的，相似的，高度相似的这些词是EMA和FDA为了上述目的使用的专有名词（参看FDA网站），所以使用这些词时应加以小心，请看下文。
EMA处理生物仿制药的首要问题可比性（在此定义为外部可比性）采用的方法是内部可比性概念的逻辑延伸，内部可比性概念最初由FDA提出，并被人用药品注册技术要求国际技术协调会议（ICH）Q5E指导方针概念化（参看参考资料3）。
事实上，欧洲仿制药协会（EGA）在其对FDA2010年的公开生物仿制药会议的回应中指出：
应注意到EMA从未限制过任何一家公司对其自身产品的生产改进提出的可比性申请，而是将其视为一项与被比较的两实体的来源（生产改进或生物仿制药）无关的科学评估。
因此，尽管我们都认识到ICHQ5E将可比的定义为有高度相似的质量属性并将其使用限制到一家公司自身的产品，但是欧盟指导方针在相同的监管文件中交替地使用着相似性和可比性这两个术语并认为这两个术语指的是相同的科学原则。
EGA进一步指出：
鉴于欧盟的成功，相似性和可比性的科学基础是相同的，监管者极力将这些原则一贯地应用到原研生物制品和生物仿制药上。
高度相似性形成了简化临床程序、可批准性、适应症外推、可互换性和病人及医疗人员信任的基础。
然而，上述EGA声明中的潜在要害是这样一种方法暗示生物仿制药的生产者拥有：
第一，与创新者就原研药的特性和行为有同样广博的知识面；
第二，为作出比较可获得适当的对照材料。
关于第二点，尽管存在对照品的来源可通过在开放市场上购买原研药以解决的观点，这种方法自身还存在问题。
原研药的配方基质可能会干扰原研药和生物仿制药之间必需的比较试验。
因为可能需要某种类型的去配方或从原始药物产品配方中提取活性成分，这样处理样本可能会导致产生的对照材料有所改变并进而产生误导性的比较结果。
这一问题已被EMA和FDA意识到，因此正需要一种有效的去配方和从商品化药物产品中提取活性药物成分的方法（参看FDA网站）。
实现这种有效的去配方和提取流程的一种可能的方法也许需要生物仿制药的生产者将其药物分子放入与原研药相同的配方中并与原研药共同处理以进行更潜在有效的对比试验。
关于适宜的对照材料的一个更有趣的点是相对于评估生物仿制药的监管机构的裁决范围而言对照材料的来源。
对EMA而言，对照材料必需来源于其裁决范围，而对FDA而言如果能提供这种材料和一种美国批准的对照品的一种可接受的衔接研究那么在其裁决范围之外的对照材料也可以使用。
第二个挑战是定义可比性的可接受程度以证实两种或多种生物制品事实上是可比的、相似的或高度相似的的声明。
正如之前已说过的，鉴于蛋白质生物药物及其生产过程的内在复杂性使用"
相同的"
一词是不恰当的。
对蛋白质药物，简单的改变，如单个氨基酸的突变或共价修饰（转录后修饰，PTM），都可能导致高级结构的微小变动。
这些微小的变动可能导致药物不起作用，或者更糟的是，由于聚集或免疫原性导致药物失效。
因此，定义作为可接受程度的词"
、"
真的是一大挑战。
特别是，如本文之前提及的，在生物仿制药领域"
一词专门被EMA使用，"
一词专门被FDA使用。
不幸的是，这种词的使用只是进一步增加混淆，所以值得再次强调决定如何以及何时使用这些词时应特别小心。
就EMA而言，已制定了各种各样产品特异的生物仿制药指导方针（参看EMA网站）（例如，重组红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子）并继续在制定指导方针（例如干扰素β和单克隆抗体）来帮助指导生物仿制药的申请者更有效地规划他们的可比性实验。
接下来，我们将讨论治疗用蛋白在FDA看来不能被充分测量（如上述讨论）的三大特征，以及可获得的和正在开发的用于确定这些特征的分析工具。
我们还将根据这三大特征相关的审查指南讨论开发生物仿制药的关键挑战。
转录后修饰
蛋白质有多种转录后修饰。
常见的转录后修饰有糖基化（包括半乳糖苷化、岩藻糖基化、高甘露糖衍生物和唾液酸糖苷化）、氧化、磷酸化、硫酸化、脂质化、二硫键形成和脱酰氨基化。
这些化学变化大多数发生在体内，但有些化学变化在体外也能发生：
例如，在生产过程中的各个阶段如纯化和贮存。
转录后修饰带来的变化对蛋白质活性有影响，所以在生产生物制品时有必要表征并理解他们。
另外，转录后修饰可能会影响生物制品的免疫原性。
几篇全面的综述谈及生物制品的免疫原性并含有转录后修饰对免疫原性的潜在（一个或多个）贡献的讨论。
对几种转录后修饰（例如脱酰胺基化、氧化和差异性糖基化）而言，临床上并没有显示出生物制品的转录后修饰和免疫原性间有直接的关系。
尽管如此，我们已经知道转录后修饰可以改变蛋白质结构和导致聚集，并且这些改变可以引起免疫原性的问题（下文还讨论了糖基化和氨基酸异构化）。
因此，注意到转录后修饰和理解他们对每种生物制品的作用是至关重要的。
另外，要证明一种生物制品的生产是可重复的，生产者需要在生产过程中监测很多步骤中的转录后修饰，监测过程需要识别转录后修饰、控制其水平和评估他们对蛋白质的影响。
开发和商品化生物制品过程中允许的转录后修饰变异性水平可以改变并通常由他们的重要性和之前的生产历史中的相关信息决定。
在大多数情况下，不同的转录后修饰对变异在数量上、水平上和形式上的明确影响（或临床结果）还为未可知。
尽管转录后修饰的表征是蛋白质组学研究中一项非常让人望而生畏的任务（在同一样本中，如果没有上千的话，也有成百个蛋白质要研究），生物制品代表一种简单得多的案例。
对生物制品，蛋白质的序列和一致性已知，各种各样的修饰形式通常可以分离得到，有时候数量巨大。
所以，生物制品转录后修饰的表征比在全面的蛋白质研究中更直接。
仪器出售商设计了软件用于识别修饰是否存在、修饰的数量以及有时候确定修饰发生的部位。
然而，转录后修饰的分析并不是没有极限的。
尖端的仪器、熟练的分析员和时间都是必需的。
尽管电脑和自动化减轻了负担，还是有很长的一段路要走。
质谱分析（通过检测质量的改变）是检测和研究蛋白质修饰的一种极为有用的工具，他们可以用于确定修饰发生在蛋白质上的哪个部位（通过分析肽段和他们的质量的改变）和用于阐明什么导致了修饰（通过比较不同种类的样本、贮存条件和配方）。
几篇关于将质谱分析用于转录后修饰这个主题的详尽的综述重点讲述了一些趋势。
最近，一种趋势是越来越强调了解参与到糖基化过程中的糖类的本质的重要性。
考虑到各种各样的细胞系、表达宿主和实验方法都能导致不同的糖基化形式，通过质谱分析测定和了解糖基化是至关重要的。
另外，要了解批次和批次间的差异和比较原研药与生物仿制药蛋白，就需要确定糖基化发生的部位（这在肽图分析实验中相对比较直观）和单糖的结构和含量（这就更难了，即便对于质谱分析而言）。
例如，一项比较一种原研的组织纤溶酶原激活物及其生物仿制药的糖基化形式的研究证实在原研药中一个N联糖基化位点上糖基化的数目是生物仿制药中的2.5倍。
一种原研单克隆抗体曲妥珠（赫赛汀；
基因泰克/罗氏）和一种生物仿制药之间的区别通过液相色谱－质谱分析（LC-MS）很容易就能检测到，包括重链上糖基化的改变和氨基酸的突变。
酶消化后用LC-MS分析重组及人源凝血因子IX表明人源蛋白和重组版本的岩藻糖基化位点是不同的。
这些差异的临床后果尚不清楚。
最近报道表明尽管观察到依那西普（恩利；
安进/辉瑞），阿法达贝泊汀（Aranesp；
安进/协和发酵麒麟株式会社）和利妥昔（美罗华；
百健艾迪/基因泰克/罗氏）在流程改变被批准后糖基化水平有所改变，但这些改变的临床后果尚不清楚。
在少数案例中，涉及一个或两个单糖和/或它们连接特异性之间的差异（大多数源于不在人体中合成而在用于生产重组蛋白的哺乳动物的细胞中合成的糖类）和免疫反应联系了起来。
半乳糖-α-1,3-半乳糖连接或末端-α-1,3-半乳糖与西妥昔单抗（爱必妥；
百时美施贵宝/礼来/默克雪兰诺）的过敏反应和对牛凝血酶的免疫反应有关。
已知唾液酸N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc；
又名NGNA）与免疫原性组织相关，所以非常期望能减少或消除重组蛋白中的这类糖。
最近，对西妥昔单抗和帕尼单抗（维克替比；
安进）中Neu5Gc的比较显示Neu5Gc存在于西妥昔单抗而非帕尼单抗，并显示向培养基中添加Neu5Ac（N-乙酰神经氨糖酸）减少了Neu5Gc的吸收。
因此，质谱检测糖类的改变的能力对生物制品而言是极为有用的，包括用于通过发现非一致性添加分析人类糖基化通路和用于评估不同的糖基化形式是否有临川意义。
应用质谱分析研究转录后修饰的另一个趋势是人们注意到了修饰本身可以被该分析方法所改变。
为了矫正这一缺陷，近年来可替代经典的碰撞诱导解离的质谱裂解方法的其他办法日益变得越来越重要。
自下而上的方法，即将蛋白质分解成肽段然后确定所有肽段的质量的方法的价值已很好地确立了，但是现在证明用自上而下的方式来分析也是有用的。
在自上而下的分析中，质谱仪内进行的是全蛋白的表征（而不是裂解片段的集合），其中如电子转移裂解（ETD）和电子捕获裂解（ECD）之类的裂解方法被用于将蛋白质裂解为更小的片段进行更详细的分析。
ETD和ECD不仅能够保存不稳定的转录后修饰，而且能够保存常见的蛋白质不稳定结构（如二硫键）（这些结构可能会在其他裂解方法中被弄混乱）。
氨基酸的异构化是转录后修饰的另一种重要的形式，其检测正受益于不断发展的技术。
一种让人特别不安的氨基酸是天冬氨酸因为它可以很容易地异构化形成异天冬氨酸（isoAsp），有报告称这会有某些不受欢迎的免疫原性后果。
异天冬氨酸形成可能是通过天冬氨酸直接异构化或者是通过天冬酰胺的脱酰胺作用，它从一种常见的琥珀酸盐中间体转化而来。
这些微妙的异构差异（质量差异为零）很明显给检测和分析带来了重大的挑战，并且这一问题在大的蛋白质中更为复杂。
质谱可以被用于检测和表征异天冬氨酸，尤其是配以ETD或ECD。
一个涉及β-淀粉样蛋白的案例，在天冬氨酸残基位点进行酶切（使用胞内蛋白酶AspN），借此ETD-MS可以在低至0.5%的水平定量异天冬氨酸/天冬氨酸的比例。
然而要实现这种分析可能需要相当多的专业知识和时间。
定位、检测和表征蛋白质上的N联糖基化的一种不错的办法是将其酶解下来然后用质谱进行分析。
然而，在O联糖基化的情况下必需非常小心因为化学裂解和释放步骤通常可能会引起糖链本身的断裂，所以可能需要考虑替代策略。
虽然O联糖基化位点可以通过新的更软的电离质谱技术在完整的蛋白质上被检测到，但是连接位点共价结构的信息通常很难通过质谱分析得到。
一种非常适合O联糖基化分析的方法是核磁共振光谱分析法。
事实上，这就是在大量报道的肝素污染案例中使用的突破性技术，在此案例中，污染物过硫酸化硫酸软骨素被600MHz的核磁共振光谱探测到，还显示了O联糖链的位置、一致性和转向。
传统NMR分析蛋白质的一个普遍的限制因素是需要大的样本数量（高达约20mg）以收集有意义的数据。
然而，NMR技术最近的发展包括流式NMR和最新的微型线圈NMR已改变了这一看法。
在后一种技术中，检测限低于100pmol时仍可能获得高质量的光谱。
在最近一个分析蓝藻细胞提取物的例子中，检测液相色谱分离后只占混合物1%的代谢成分已成为可能（总注射量为30μg）。
偶联MS与NMR后分析能力更为强大。
LC-MS-NMR技术能够很好地平衡MS和NMR方法在要求上的巨大差异（如样本质量和分析时间），并利用NMR弥补MS分析无法确定结构的缺点。
这一技术对生物制品一项颇具吸引力的扩展可能是首先用高效液相色谱和超高效液相色谱分离用于蛋白质组学研究的混合物，然后将流出物分成两份，一份用于质谱，一份用于串联质谱，再用微型线圈NMR分析所选特征。
LC-MS-NMR技术将来的发展有望被应用于表征转录后修饰。
高级结构
尽管分析初级结构的工具的开发取得了重大进步，正如上文所讨论的，但是这些研究中缺失的是转录后修饰对生物药物产品三维结构的影响的认识。
确定蛋白质三维形状和最终影响蛋白质功能的是蛋白质的高级结构，即二级、三级和四级结构。
因此，监测完整蛋白质的高级结构的能力对表征生物制品有着显著的重要性。
高级结构的差异不仅为任何蛋白质及其变体形式（即带有转录后修饰的蛋白质）之间观测到的生物学和/或免疫学差异提供可能的线索，而且还可以作为评估生产过程改变前后原研药产品不同版本之间以及评估原研药和生物仿制药之间缺乏相似性的一种方法。
尽管表征生物药物蛋白的高级结构是一项重大的挑战，但是通过特殊分析方法在各种各样的前沿领域的使用，我们取得了不错的进展。
蛋白质的高级结构是各种力相互作用的结果，很多力当单独考虑时都很微弱，但结合后就变得强大。
对所有蛋白质而言，这些弱的相互作用在整体构象和构象动力学中扮演重要的作用。
在生物药物蛋白的生产过程中（包括如细胞培养、过表达、纯化、转移、储存和处理等步骤），可能会遇到能扰乱蛋白质中某些弱相互作用力的因素，导致在不改变蛋白质一级结构的情况下改变其三维结构。
此类改变可以很形象地被称为沉默改变因为它们没有化学共价特征，化学共价特征可以作为改变的探测依据。
由于没有可以探测和表征这些构想变化的分析工具，其对结构－功能相互关系的影响尚未为可知。
最后，溶液中的蛋白质动力学（包括蛋白质结构呼吸，多肽链弯曲，不规则的局部结构和局部蛋白质结构去折叠）是蛋白质行为的另一项重要属性，但由于缺乏适宜的实用常规分析工具（见下文讨论）所以在生物药物分析中对其几乎一无所知。
蛋白质结构测定的两种主要技术是X射线晶体衍射和NMR。
不幸的是，这些技术用于高级结构可比性研究时出现了较大的问题。
X射线晶体衍射对常规测试不适用的原因是样本必需首先被晶体化--由于结构的原因（即由于蛋白质中转录后修饰和/或无序区域的存在）能否结晶是一件不能确定的事情。
借由X射线晶体衍射的结构分析也通常太过耗时，对于常规生物药物分析太过复杂。
对于NMR，蛋白质生物药物大的结构（及其结构原件复杂的排列）、对NMR信号相对低的敏感度和生物药物中活性核（除了1H同位素）低的天然丰度都使得这项技术对常规高级结构可比性研究而言显得不实用。
然而，在特定的情况下，小的蛋白质生物药物正在被开发，用简单的一维1HNMR产生NMR指纹可能提供了一种非常有用且实际的可比性评估方法。
使用二维NMR检测生物药物的实例已有报道。
然而，这些应用也只是用于小的蛋白质生物药物，并且为一个样本上就需要花费很长的时间采集数据（尤其是使用了活性核的天然丰度水平时），这同样使得该方法对常规应用而言显得不实用（常规应用需要比较很多样本）。
虽然现在应用NMR于常规的蛋白质生物药物可比性分析的机会有限，但是我们注意到似乎这一技术用于多糖类生物药物更为可行（见下文关于NMR和肝素的简要讨论）。
其他经典的生物物理技术如圆二色谱、（内源）荧光（光谱）、差示扫描量热法、等温量热法、分析型超高速离心（AUC）、尺寸排阻色谱（SEC）和各种各样的染料结合分析法可被用于表征蛋白质结构。
这些方法的主要局限在于他们提供的信息普遍来源于被检测蛋白很多不同部位输入信号的总和。
这类检测所得到的信息对应的是生物药物整个结构的全体平均值。
例如，圆二色谱检测表明的只是蛋白质中存在的每种主要的基本二级结构元件（α-螺旋、β-折叠、无规卷曲）的平均百分比。
如果所分析的蛋白质含有几种α-螺旋并且被比较的两个样品中的一个样品上只有一种α-螺旋的一部分被修饰了，生物药物学家面临的是试图从两个巨大的信号中区分出一小部分不同信号的艰难任务。
另外，检测这种差异的能力也会随着内在噪声水平的变化而变化，而内在噪声水平在很多情况下与实际差异相比显得比较大。
因此，经典的生物物理工具并不是很适合检测小而细微的蛋白质构象上的差异或者即便生物药物产品发生了较大的改变但是这些改变了的分子只代表溶液中所有分子中的一小部分。
即使观察到了改变，这些技术只能提供很少甚至无法提供改变发生在分子中的哪个部位的信息。
因此，我们很需要其他能够以一种实用且常规的方式提供更多信息的方法。
蛋白质标记方法如氢氘交换质谱（HDX-MS）和共价标记策略的使用对检测生物药物高级结构中微小的变化来讲是有价值的。
重要的是，当探测到改变时，这些技术可以提供关于生物药物分子中改变发生部位的信息。
在HDX-MS中，蛋白质暴露于重水（D2O）中，于是可交换的氢原子被标记上了氘，因此每个氨基酸上增加了一个额外的可测的单位质量。
这种交换是由蛋白质结构和动力学所决定的。
通过在生理条件下进行交换和实时分析，可得到蛋白质动力学方面的信息和蛋白质高级结构间可比性的信息。
HDX-MS提供含有丰富信息的数据，高度敏感（完全表征只需1－2纳摩样品），可以自动进行，并可以定位生物药物特定区域上变化或差异发生的部位；
更有，单个氨基酸水平的分辨率已经成为可能了。
目前的局限仍然是解释数据所需要的分析时间以及由于质谱分析不兼容溶液环境（例如含有洗涤剂的缓冲液）而引起的复杂性；
然而，这些局限最近几年已经有了重大改进。
最近，HDX-MS被用于研究一种重组免疫球蛋白G1单克隆抗体的构象和构象动力学，并被用于监测移去其糖链、改变其寡糖结构和受体相互作用后其高级结构的改变。
获取这些以及类似数据的能力对构建生物药物结构方面的完整图像起到帮助的作用，结构方面的完整图像对于了解其功能、最大化其稳定性和了解如糖链类的转录后修饰如何影响局部以及整体特征和性质起到至关重要的作用。
由于HDX-MS可以显示蛋白质高级结构中的细节以及蛋白质动力学，该方法有潜力成为评估原研药及其生物仿制药之间相似性实验的一种重要工具。
需要提到的是，由于HDX-MS可以被用于监测生物药物与那些被认为对其生物学功能非常重要的靶蛋白之间的相互作用的效果，所以这项技术在生物药物研发阶段可能也有重要作用。
由于高级结构的很多方面可通过正确地形成二硫键驱动，所以在蛋白质的生产和处理过程中，知晓他们的位置和核实他们正确形成了是非常重要的。
在最近的实例中，通过LC-MS在血液凝固调控因子tPA和治疗用单克隆抗体上对二硫键的分布进行了全面的表征。
分析这些生物药物的关键是使用小心控制的酶解、软电离（电喷雾电离）和温和的破碎（ETD）。
在这些方法被开发出来以前，广泛使用的是同源比较建模法（借助已有的晶体结构）。
在实际的药剂上进行测量的能力，不论有多复杂，都将成为
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