基因工程期中作2315210业Word下载.docx

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　　是农业生物技术的主要内容。

　　是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。

4.转基因动物

　　将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。

　　使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。

2、基因工程在工业中的应用

1.纤维素的开发利用

　　克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。

2.酿酒工业

　　用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。

或用酿酒酵母生产蛋白质等。

三、基因工程在医药上的应用

1.用转基因植物或动物生产药物

2.用微生物生产药物

　　大肠杆菌或酵母菌生产激素（如胰岛素）、干扰素等

3.技术设计高效高特异性的生物制剂

　　应用定点突变技术设计蛋白质或酶的结构，制造出高效高特异性的生物制剂

4.研制疫苗

　　制造新型疫苗（如HIV、乙肝、丙肝、霍乱、痢疾、SARS）

5.基因诊断

6.法医鉴定

7..基因治疗

将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。

四、基因工程在环境保护中的应用

1.检测水污染

用重组细菌或转基因鱼等检测水污染

2.生物降解

用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。

第二章基因工程的酶学基础

1、限制性核酸内切酶的概念及其功能

限制性核酸内切酶：

是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。

功能：

自我保护作用。

（1）限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。

（2）修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。

2、限制性内切酶的命名原则

1）用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。

2）用一个右下标的大写字母表示菌株或型。

如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。

3）如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。

如EcoRI，EcoRV。

4）限制酶前面要带上R（Restriction），

修饰酶前面要带上M（Modification）。

（现已省略）。

3、限制性内切酶的有哪些类型？

各有什么特点？

I型限制性内切酶

（1）识别位点序列

未甲基化修饰的特异序列。

EcoB：

TGA（N）8TGCT

EcoK：

AAC（N）6GTGC

（2）切割位点

在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链。

II类限制性内切酶

未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。

与DNA的来源无关。

切开双链DNA。

形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）

III类限制性内切酶

在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。

4、II类限制性内切酶的作用特征有哪些？

什么是粘性末端？

有什么作用？

识别位点序列：

切割位点：

粘性末端：

含有几个核苷酸单链的末端。

作用：

①连接便利②5’末端标记③补平成平齐末端。

5、什么是同裂酶？

有哪两类？

有什么特点？

同裂酶是识别位点的序列相同的限制性内切酶。

类别：

①完全同裂酶：

识别位点和切点完全相同。

如HindⅢ和HsuI。

②不完全同裂酶：

识别位点相同，但切点不同。

如XmaI和SmaI。

6、什么是同尾酶？

识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。

如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等

7、什么是内切酶的星号（*）活性？

如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。

8、影响限制性内切酶活性的因素有哪些？

1.DNA的纯度

2.DNA的甲基化程度

3.温度

4.缓冲液（Buffer）

9、内切酶与识别序列的结合模式是什么？

通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。

10、限制性内切酶对DNA的消化作用有哪两种形式？

如何使反应终止？

1.内切酶与识别序列的结合模式

2.完全消化与局部消化

大多数酶可用65oC温育5分钟失活。

或用乙醇沉淀DNA。

11、什么是DNA连接酶？

简述其类型及其作用特点和DNA连接条件？

从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。

1.两种DNA连接酶

（1）大肠杆菌连接酶：

只能连接粘性末端。

（2）T4噬菌体的连接酶：

不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。

2.连接条件：

（1）必须是两条双链DNA。

（2）DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。

（3）需要能量：

动物或噬菌体中：

ATP

大肠杆菌中：

NAD+

12、连接酶的连接反应的机理是什么？

1.ATP（NAD+）提供激活的AMP。

2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。

3.AMP与连接酶的赖氨酸e-氨基相连。

4.AMP随后从连接酶的赖氨酸e-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。

5.3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。

13、影响连接反应的因素有哪些？

1.插入片段与载体的浓度比例：

10~20倍。

2.反应温度：

12.5℃，一般14~16℃

14、什么是DNA聚合酶？

基因工程中常用的DNA聚合酶有哪些类型？

DNA聚合酶（DNApolymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。

DNA聚合酶,以DNA为复制模板，从将DNA由5'

端点开始复制到3'

端的酶。

DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。

基因工程中常用的DNA聚合酶：

1.大肠杆菌DNA聚合酶

2.Klenowfragment

3.T7DNA聚合酶

4.T4DNA聚合酶

5.修饰过的T7DNA聚合酶

6.逆转录酶

15、常用的DNA聚合酶的特点有什么？

1.共同特点：

把dNTPs连续地加到引物的3’—OH端。

2.主要区别：

持续合成能力和外切酶活性不同。

T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。

其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。

16、论述：

主要DNA聚合酶在基因工程中的作用和主要用途

1.大肠杆菌DNA聚合酶I：

主要用来制备带放射性标记的DNA探针。

2.Klenowfragment：

①3’端补平：

补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。

②DNA3’末端标记：

在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。

③cDNA第二链的合成

3.T4DNA聚合酶：

①补平隐蔽末端

②DNA3’末端标记：

用3’®

5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端（平端、3’隐蔽端、5’隐蔽端）制造出3’隐蔽端。

再利用它的5’®

3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。

4.T7DNA聚合酶：

①以大分子量DNA为模板的合成：

如M13

②进行末端标记：

与T4DNA聚合酶相同。

③补平隐蔽末端：

合成补平3’隐蔽末端；

水解修平3’突出末端。

5.修饰后的T7DNA聚合酶：

①DNA测序：

双脱氧法。

②标记DNA3’隐蔽末端

③更有效地补平末端

6.逆转录酶：

①合成cDNA：

以oligodT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。

②合成DNA探针：

用随机引物（randomprimer）或oligodT做引物。

17、什么是DNA修饰酶？

DNA修饰酶能对进行化学修饰，修饰的位点可以在碱基，也可以在脱氧核糖。

修饰的方法可以是甲基化，乙基化等等。

18、什么是末端脱氧核苷酸转移酶？

简述其作用及其作用特点和作用？

末端脱氧核苷酸转移酶是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3'

羟基端。

带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。

（1）同聚物加尾：

给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。

（2）再生酶切位点：

便于回收克隆片断。

（3）非放射性标记DNA片断的3’端：

催化非放射性标记物参入DNA片断的3’端。

（生物素-11-dUTP等）

19、什么是T4多核苷酸激酶？

简述其功能及其作用？

分离自感染了噬菌体T4的大肠杆菌细胞，可将ATP中γ磷酸基转移到具有5′端羟基的DNA或RNA分子上的酶。

催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。

如果ATP的γ磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5’端。

DNA5’-OH端磷酸化、标记DNA的5’端。

20、什么是碱性磷酸酶？

简述其特性及其用途？

碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织，。

这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端

特性：

催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。

用途：

（1）防止线性化的载体份子自我连接

21、什么是核酸外切酶?

简述核酸外切酶的种类及其主要酶活性和应用？

是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。

1.核酸外切酶Ⅲ（exoⅢ）：

识别3’-OH，在DNA双链的末端产生出单链区域。

与klenow配合进行3’端标记

2.核酸外切酶（λexo）：

识别5’-P（但不能降解5’-OH）

使DNA双链变成单链（短）。

3.T7基因6核酸外切酶：

既能识别5’-P，又能识别5’-OH。

用途与lλexo一样。

22、什么是S1核酸酶？

简述其特性及其功能和用途

S1核酸酶是催化降解单链DNA或单链RNA（对单链DNA的活性更高），产生以5′-磷酸基末端的单核苷酸或寡核苷酸的酶。

（1）高度单链特异性

（2）反应条件：

①低水平Zn2+②pH4.0~4.3

（1）催化单链RNA或DNA降解。

（2）切掉双链核酸中的单链区。

（3）降解限制酶切形成的单链突出端。

（4）不能降解双链DNA或RNA-DNA杂交链

（1）定位RNA

（2）用mRNA测定基因中的外显子序列

23、简述Bal31核酸酶特性及其功能和用途

既有单链特异的DNA（RNA）内切酶；

又有双链特异的DNA外切酶。

降解双链DNA或其上的单链缺口、未配对的单链区域。

定位测定DNA片断中的限制酶位点分布。

第三章基因工程载体

1、什么是载体？

基因工程对载体的要求有哪些？

在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。

基因工程对载体的要求：

（1）在宿主细胞内能独立复制。

（2）有选择性标记。

（3）有一段多克隆位点。

外源DNA插入其中不影响载体的复制。

（4）分子量小，拷贝数多。

（5）容易从宿主细胞中分离纯化。

2、什么是质粒？

质粒的一般生物学特性有哪些？

其质粒空间构型与电泳速率有何关系？

质粒（plasmid）：

是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。

质粒的一般生物学特性：

（1）分子小：

1—200kb

（2）编码基因少：

2—3个中等大小的蛋白质。

（3）环形状：

双链环状DNA。

（4）质粒的空间构型：

①共价闭合环状DNA（cccDNA）

②开环DNA（opencircular，ocDNA）③线形DNA（linear，lDNA）

质粒空间构型与电泳速率：

同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：

scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。

3、什么是接合型质粒和非接合型质粒？

什么叫做质粒的迁移作用?

接合型质粒：

又叫自我转移型质粒。

除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。

非接合型质粒：

虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。

质粒的迁移作用：

能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。

4、质粒的复制类型有哪两类？

各有何特点？

什么是质粒不亲和性？

1.严紧型质粒（stringentplasmid）：

拷贝数少，只有1—3份拷贝。

2.松弛型质粒（relaxedplasmid）：

拷贝数多，有10—60份拷贝。

所谓质粒的不亲和性（plasmidincompatibility），有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。

5、质粒载体必须具备的基本条件有哪些？

（1）具有复制起点（ORI）

（2）具有抗菌素抗性基因

（3）若干限制性内切酶的单一位点：

（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。

6、蓝白斑筛选的原理是什么？

①Xgal：

（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）

②b-半乳糖苷酶Xgal显色反应：

bβ-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。

③lacZ的a肽互补

④IPTG的诱导作用：

IPTG是乳糖的类似物。

能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ的C端部分和载体的lacZ’a肽都表达。

从而互补。

7、人工构建的质粒载体有哪几种类型？

（1）高拷贝数的质粒载体

（2）低拷贝数的质粒载体

（3）失控的质粒载体

（4）插入失活型质粒载体

（5）正选择的质粒载体

（6）表达型质粒载体

8、pSC101载体、ColE1载体、pBR322载体的主要特点？

1.pSC101：

第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体。

2.ColE1：

在培养基中加入氯霉素抑制细菌蛋白质合成后，质粒仍然能复制达到每个细胞1000-3000拷贝之多！

3.pBR322：

F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。

9、pUC系列载体的特点和优点？

特点：

约2.7kb，10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ’基因的5’端。

Ampicillin抗性和lacZ的a肽互补（蓝白斑）相结合。

优点：

①更小的分子量：

如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。

②选择方便

③克隆便利：

具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。

④测序方便

10、pGEM-3Z载体的特点？

①如果加入纯化的T7或SP6RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA

②外源基因正接反接都可以转录。

③MCS与pUC18的完全一样。

11、穿梭质粒载体的特点和优点有哪些？

人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。

①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。

③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。

12、什么是质粒的差度？

每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度。

低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。

高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。

13、什么是噬菌体的溶菌周期和溶原周期？

溶菌周期：

烈性噬菌体（virulentphage）感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。

溶原周期：

温和噬菌体（temperatephage）感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。

形成这一过程称为溶源化（lysogenization）。

14、简述M13噬菌体的生活周期及其构建策略和构建的技术路线以及M13系列载体的优点和缺点。

生活周期：

M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA→

+DNA合成－DNA，形成RFdsDNA→－DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白→组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞

构建策略和构建的技术路线：

（1）克隆区域的选定

①基因间隔区（intergenicregion,IG区）M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。

②酶切位点：

IG区内只有一个BsuI切点。

其余9个BsuI限制性位点分布在其它部位。

（2）加入酶切位点

①在IG区内加入单一内切酶位点：

第一个M13载体：

M13mp1：

在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（a-肽序列）。

利用a-肽序列中的三个单一酶切位点（BglII、AvaII和PvuI）。

（3）M13载体系列：

①M13载体系列的命名：

M13mpnn代表系列数字

②对M13mp1的改进：

加上常用的酶切位点。

③对M13mp2的进一步改进：

在M13mp2的LacZ’的5‘端加上一段人工合成的多克隆位点（MCS）。

（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段

（2）Xgal显色反应，可供直接选择

（3）无包装限制，克隆能力大

（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链

缺点：

①插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降

②实际克隆能力小于1500bp。

15、什么是噬菌粒载体？

简述pUC118/pUC119载体的构成、特点和噬菌粒载体的包装。

噬菌粒载体：

由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。

①构成：

1）M13的基因间隔区（IG），带有M13复制起点。

2）pUC18/pUC19质粒载体：

质粒复制起点Ampr；

lacZ’；

MCS

②pUC118/119的复制模式：

1）双链质粒复制模式：

受pUC本身的复制起点（来源于ColE1）的控制。

2）单链滚环噬菌体复制模式：

当寄主细胞被辅助噬菌体M13感染后。

来源于M13的复制起点被辅助噬菌体的基因II产物控制。

③噬菌粒载体的包装：

1）辅助噬菌体：

自身的复制起点发生了突变，复制效率低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。

2）包装：

16、pBluescript噬菌粒载体的特点和常用的pBluescriptSK/KS（+/-）载体如何区分？

1）定向体外转录：

MCS两侧分别加上T3和T7噬菌体的启动子。

加入适当的噬菌体RNA聚合酶，就可以定向体外转录。

2）两种复制模式：

既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装。

3）选择方便：

有Ampr和lacZ’，可以进行Amp抗性选择和Xgal-IPTG蓝白斑选择。

4）插入方便：

18个单一酶切位点的MCS

pBluescriptSK/KS（+/-）区分：

17、T载体的特点和优点？

MCS的中部已经切开，各有一个3’端突出的T。

PCR产物往往在3’端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。

可在真核生物表达外显子捕捉

Tvector的克隆过程——简便

18、什么是噬菌体展示载体？

将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面。

19、什么是λ载体的cos位点？

理解λDNA的两种复制模型。

lλDNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。

lλDNA的复制模型：

（1）θ型复制：

λ噬菌体感染细菌的早期：

双链进行θ型复制。

（2）滚环复制：

感染的晚期：

启动滚环复制机制。

形成多联体λDAN分子。

20、简述λ噬菌体载体的构建构建原理和构建过程以及人工构建的λ噬菌体载体的两种类

型的特点。

（1）构建原理：

删除l噬菌体的非必需区，留出插入空间。

（2）构建过程：

①在这个非必须区内制造限制酶切点

②引进某些突变表型，作为选择标记

③突变某些基因，使它成为安全载体

④删除λDNA必须区段上常用的限制酶切点

（3）人工构建的λ噬菌体载体有两种类型：

①插入型载体（insertionvectors）：

1）免疫功能失活型：

插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。

2）b-半乳糖苷酶失活型载体：

在λ基因组中引入了LacZ’序列。

（其上含有一个EcoRI克隆位点）。

②替换型载体（substitutionvectors）：

两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于lDNA的非必须区两端。

1）λEMBL4：

λEMBL4的可置换片断内部还有SalI酶切位点。

以便于进一步消化中间片断，防止自我连接。

2）Charon40：

Charon40的可置换片断是由DNA短片重复构成，片断之间有HaeI切点。

在克隆的时