分子生物学重点知识总结Word格式.docx

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8.凝胶过滤层析

凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。

9.多重PCR

多重PCR技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等技术加以鉴别。

10.荧光域值

荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值的设置是基线荧光信号的标准偏差的10倍。

11.退火

温度突然降至37-58℃时，变性的DNA单链在碱基互补的基础上重新形成氢键开始复性。

12.基因诊断

基因诊断是通过检测基因的结构异常或其表达异常，对人体的健康状态和疾病做出诊断的方法。

13.实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

二、问答题

1.什么是SNP？

试述研究SNP的意义。

真核生物基因组中存在大量的DNA多态性。

DNA多态性是指DNA序列发生变异从而导致的个体间核苷酸序列的差异，主要包括单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）和串联重复序列多态性（tandemrepeatspolymorphism）两类。

研究SNP的意义：

SNP是由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。

据估计，人类基因组中每1kp就存在一个SNP位点，共有约300万个之多，远多于其它类型的DNA多态性，是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性，相当一部分还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易感性或抵抗能力、对药物的反应性等相关。

SNP被认为是一种能稳定遗传的早期突变。

2.简要介绍质粒并举例说明其在分子生物学中的用途。

质粒（plasmid）是一类染色体外具有自主复制能力的环状双链DNA分子，属染色体外基因组。

质粒与致病菌的毒力及耐药性有关，又是基因工程的常用载体，因而具有重要的研究和应用价值。

其在分子生物学中的用途有：

1.质粒DNA编码多种蛋白质，有的与质粒自身的复制和稳定性有关，有的控制宿主细胞的各种性状，如各种抗性、代谢能力、致病性、接合转移等。

根据宿主的表型可识别质粒的存在，这一性质广泛应用于重组菌的筛选和鉴定。

2.质粒的不相容性常用于质粒的分类。

基因工程中以质粒为载体进行基因克隆也是利用了质粒的不相容性原理。

3.请介绍目前蛋白质组学研究中最常用的基本技术流程并简述其原理。

蛋白质组学研究需要两条互补的实验工作流程——基于凝胶的工作流程（Gel-basedworkflow）和基于液相色谱的工作流程（LC-basedworkflow）。

在这两种流程中，基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广泛的、发展最为成熟的工作流程，通过样品制备、样品标记、双向电泳分离、图像获取、图像分析，到抠点、酶切、点靶和MALDI—TOF蛋白鉴定等一整套技术手段下来，如果还加上操作自动化，研究人员可以很方便的获得蛋白质性质数据。

而基于液相色谱的工作流程则可以对在双向电泳中难以分离鉴定的高相对分子量、低相对分子量、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋白质进行有效的分离鉴定。

这两种方法结合起来可以对复杂样品进行预分离、对低丰度蛋白进行富集，还可以完成蛋白酶解后多维液相分离（MDLC）。

4.简述酵母双杂交技术的原理及其用途。

酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。

酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。

细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。

反式转录激活因子，往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域（DNAbindingdomain，DNA-BD）和转录激活结构域（activationdomain，DNA-AD）。

这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstreamactivatingsequence，UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。

基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中：

1.利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。

2.利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用。

3.利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响。

4.利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（GenomeProteinLinkageMap）。

第4章/第8章

1.分子克隆技术包括哪些基本步骤？

分子克隆技术的基本步骤大致包括：

①目的基因的获取；

②载体的选择；

③目的基因与载体连接；

④重组DNA导入受体细胞；

⑤重组体的筛选等；

即分、切、接、转、筛等过程。

2.目的基因和载体连接主要有哪些方法？

目的基因与载体构建成重组体的方法主要有：

1）.粘性末端DNA分子的连接2）.平末端连接法3）.通过同聚尾连接。

3.简述分子克隆中常用的工具酶及其作用。

在分子克隆技术中，常用的工具酶主要有：

1.限制性核酸内切酶，它是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶；

2.DNA聚合酶Ⅰ，它具有3种酶活性：

1）5'

→3'

聚合酶活性；

2）3'

→5'

核酸外切酶活性；

3）5'

3.反转录酶，其功能主要有：

1）逆转录作用2）核酸酶H的水解作用3）依赖DNA的DNA聚合酶作用；

4.DNA连接酶，它在DNA重组中的主要功能是催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5'

磷酸基团与3’羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组；

5.碱性磷酸酶，它的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5'

-磷酸基团；

6.末端脱氧核糖核苷酰转移酶，其功能主要有：

1）在载体或目的基因3'

末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。

2）用于DNA3'

末端的同位素探针标记；

7.核酸酶S1，其作用是除去双链DNA的粘性末端以产生平末端、除去cDNA合成时形成的发夹结构以及分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况等。

4.举例说明载体应具备的基本要素。

载体应具备以下特征：

1）能自我复制并具有较高的拷贝数，并有适宜的分子量，一般应<

10kb；

2）带有遗传筛选标记；

3）有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。

5.简述双抗生素筛选和蓝白斑筛选的原理。

1.双抗生素筛选的原理是：

因大多数质粒载体带有抗生素抗性标记的特征（如Ampr、Tetr等），当带有完整抗性基因的载体转化无抗性细菌后，被转化的阳性菌获得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未转化菌不能存活，但应排除未重组的空载体。

2.蓝白斑筛选的原理：

某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码β-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸α-肽的DNA片段，IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内α-互补，形成完整的β-半乳糖苷酶。

该酶能催化指示剂底物X-gal形成蓝色菌落。

当外源基因插入lacZ基因中MCS，lacα-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无β-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落。

6.有哪些常用的探针标记物？

常用的探针标记物有：

1.放射性同位素标记，常用标记探针的同位素有32P、3H、35S、131I、125I等。

2.非放射性标记，常用的非放射标记物有辣根过氧化物酶（HRP）、荧光素、生物素、光敏生物素、地高辛（DIG）等。

7.如何进行探针的标记？

1.放射性同位素标记探针的的方法有缺口平移法、随机引物法、末端标记法和反转录标记法等。

2.非放射性标记核酸探针的方法分为化学修饰标记法和酶促反应标记法两大类：

①化学修饰标记法是利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的某些基团发生化学反应，将标记物直接或间接结合到探针分子上。

化学标记法具有方法简单、成本低、标记方法较通用，也是目前较为常用的标记方法；

②酶促反应标记法是将标记物预先标记在单核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人到核酸探针分子中。

这种标记法具有灵敏度高的优点，但其标记过程较复杂、成本较高。

8.影响核酸分子杂交的因素有那些？

如何进行杂交条件的优化？

影响核酸分子杂交的因素有:

杂交方法的选择、探针的选择、探针的浓度、温度、杂交液的成分、反应时间等。

核酸分子杂交实验条件的优化有：

1.探针的选择：

针对不同的杂交实验，选择不同的核酸探针，在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA双链探针。

但在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单链探针或RNA探针。

2.探针的标记方法，选择什么标记方法视灵敏度和显示方法等实验要求和条件而定。

3.探针的浓度：

随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。

4.杂交最适温度，在实验前必须首先确定杂交温度。

5.杂交反应时间，一般杂交反应要进行20h左右。

6.洗膜温度，杂交后的最终洗膜温度一般应低于Tm值5~12℃进行。

7.杂交液的优化,通常用于DNA杂交的标准杂交液为5×

SSC,1.0%casein,0.1%十二烷基肌氨酸，0.02%十二烷基硫酸钠。

但除了以上成分外，必要的时候可以加一些杂交促进剂。

常用的有硫酸葡聚糖，它能促进DNA链之间的缔合。

聚合酶链反应

1、根据作用原理生物分子的分离纯化有那几类？

根据作用原理生物分子的分离纯化可分为：

（1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；

（2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；

（3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；

（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。

（5）根据配体特异性，如亲和层析。

2、什么原因易引起DNA降解，该如何解决？

引起DNA降解的原因有：

1）材料不新鲜或反复冻融2）未很好抑制内源核酸酶的活性3）提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4）外源核酸酶污染5）反复冻融。

相应的解决方法有：

1）尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融；

液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液2）在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量3）细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔4）所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌5）将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。

3、简述PCR技术的基本原理

PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制，是在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。

在反应中混合下列物质：

模板DNA、四种dNTP（包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、引物1、引物2、TaqDNA聚合酶、缓冲液及Mg2+（MgCl2），然后经下列过程大量扩增靶DNA。

基本的反应分变性、退火、延伸等三步完成。

4、简述PCR实验中常见的问题及其对策。

1）假阳性，预防假阳性可采取以下措施：

（1）PCR前后工序分室操作，试剂器材分室存放。

（2）凡耐高温的试剂器材均高压灭菌。

（3）Tip头、Eppendorf管等最好一次性使用。

（4）操作人员必须戴手套进行操作。

（5）试剂小量分装保存，用前先离心，防止开盖时液体溅出。

2）非特异性PCR产物，造成非特异性PCR产物的常见原因及其预防措施有：

（1）引物特异性不高，引物用量过多，应调换引物或降低引物用量。

（2）TaqDNA聚合酶质量不好或用量偏高，应降低酶量或使用质量较好的酶。

（3）Mg2+浓度过高，可适当调节Mg2+浓度。

（4）退火温度过低，退火及延伸时间偏长，可提高退火温度，减少退火及延伸时间，或者采用二温循环PCR进行扩增。

（5）热循环次数过多，适当增加模板用量，减少循环次数。

3）假阴性，可考虑以下原因并进行改进：

（1）引物设计是否合理，有无二级结构形成，尤其是引物3’端应无发夹结构。

（2）标本中是否有Taq酶抑制剂，Taq酶是否失活。

（3）反应体系中有无蛋白酶或核酸酶降解DNA聚合酶或模板DNA，可在95℃以上加热10分钟使其灭活。

（4）反应体系中是否有较难去除的蛋白质抑制PCR系统，用蛋白酶K重新处理常可获预期结果。

（5）循环温度，特别是解链温度是否准确，退火温度是否过高。

有些PCR仪指示温度与实际温度不符，过高则酶在前几个循环中迅速失活，过低则模板变性不彻底。

（6）检测PCR产物的方法灵敏度不够，如琼脂糖凝胶电泳法敏感性较低。

（7）靶序列发生突变、缺失等。

4）引物二聚体，形成原因有：

（1）两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3’端有互补区。

（2）引物模板比例太高，可增加模板用量。

（3）退火温度过低。

（4）热循环次数过多。

5、简述实时荧光定量PCR技术的基本原理？

在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

基因诊断

1.基因诊断常用到的方法有哪些？

基因诊断常用到的方法有：

1）PCR、2）核酸杂交、3）基因芯片、4）bDNA、5）NASBA、6）测序。

2.TaqMan技术如何设计引物和探针？

1）.TaqMan技术引物的设计原则：

序列选取应在基因的保守区段；

避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；

典型的引物18到24个核苷长（引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

）；

Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；

引物之间的TM相差避免超过2℃；

引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；

为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；

Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp；

引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

2）.TaqMan技术探针的设计原则：

先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针；

探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp），以保证结合特异性；

探针的DNA折叠和二级结构；

尽量避开二级结构；

Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合，GC含量在40%－70%；

探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'

G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；

整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；

为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。

3.如何对镰刀形细胞贫血和地中海贫血进行基因诊断？

1）、镰状细胞贫血的基因诊断原理在于它的血红蛋白中的β珠蛋白基因发生了突变，导致β链第6位谷氨酸（密码子GAG）变为缬氨酸（密码子GTG）。

因此，对镰刀形细胞贫血的基因诊断方法可有：

1>

.利用PCR-RFLP的技术进行诊断：

基于A→T的变换，改变了限制性内切酶的位点，因此在酶解正常人DNA和患者DNA后再用标记的β珠蛋白基因为探针作Southern杂交时，就会出现不同的DNA条带。

限制性内切酶MstⅡ切割的序列是CCTGAGG（其中N是任何一种核苷酸），切割正常DNA产生1.15+0.20kbβ珠蛋白的DNA片段；

若切割患者DNA时，由于A→T破坏了MstⅡ的位点（CCTGTGG），便形成1.35kbβ珠蛋白的DNA片段；

2>

.使用PCR-ASO进行诊断：

PCR-ASO使用只有几十个核苷酸的探针，检测被检DNA中的同源序列。

由于探针比较短，当被检DNA序列与探针不完全互补，甚至只要有一个碱基的差异，杂交分子就不能稳定形成。

已知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸探针，32P标记，进行SouthernBlot杂交/斑点杂交。

2）、对地中海贫血进行基因诊断：

.α地中海贫血的基因诊断：

α基因不同程度的缺失引起不同类型的α地贫，α基因缺失1～4个。

正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个αGene时可得到10kb片段。

.β654地中海贫血的基因诊断：

β654地中海贫血是指发生在β珠蛋白基因第二外显子第654位C→T突变（IVS-Ⅱ-654，C→T）而引起的一种地中海贫血，该突变在IVS-Ⅱ第654位（nt654）上出现的单碱基取代产生了一个新的GT二核苷酸，联同旁侧序列构成一个新的5′端异常的剪接位点，同时还激活了IVS-Ⅱ第579位（nt579）处3′端隐匿的剪接位点，从而将IVS-2nt589-nt652之间一段73bp内含子序列作为额外的外显子插入到外显子2和外显子3之间，产生了异常的β-珠蛋白mRNA。

在异常剪接的mRNA中存在一个提前的终止密码子，使翻译提前中止而产生截短的不稳定的异常珠蛋白，导致正常β珠蛋白链合成减少。

根据这一原理我们可以利用RT-PCR方法诊断这种类型的地中海贫血。