分子生物学重点知识总结Word格式.docx

1、8.凝胶过滤层析凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。9.多重PCR 多重PCR技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等技术加以鉴别。10.荧光域值 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值的设置是基线荧光信号的标准偏差的10倍。11.退火温度突然降至37-58时，变性的DNA单链在碱基互补的基础上重新形成氢键开始复性。12.基因诊断基因诊断是通过检测

2、基因的结构异常或其表达异常，对人体的健康状态和疾病做出诊断的方法。13.实时荧光定量 PCR 实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。二、问答题1.什么是SNP？试述研究SNP的意义。真核生物基因组中存在大量的 DNA 多态性。DNA多态性是指DNA 序列发生变异从而导致的个体间核苷酸序列的差异，主要包括单核苷酸多态性（ single nucleotide polymorphism ， SNP ）和串联重复序列多态性（ tandem repeats polymorphism ）两类。研究SN

3、P的意义：SNP是由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。据估计，人类基因组中每 1kp 就存在一个 SNP 位点，共有约 300 万个之多，远多于其它类型的 DNA 多态性，是人群中个体差异最具代表性的 DNA 多态性，相当一部分还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易感性或抵抗能力、对药物的反应性等相关。SNP 被认为是一种能稳定遗传的早期突变。2.简要介绍质粒并举例说明其在分子生物学中的用途。质粒（ plasmid ）是一类染色体外具有自主复制能力的环状双链 DNA 分子，属染色体外基因组。质粒与致病菌的毒力及耐药性有关，又是基因工程的常用载体，因而具有重要的研究和应用价

4、值。其在分子生物学中的用途有：1. 质粒 DNA 编码多种蛋白质，有的与质粒自身的复制和稳定性有关，有的控制宿主细胞的各种性状，如各种抗性、代谢能力、致病性、接合转移等。根据宿主的表型可识别质粒的存在，这一性质广泛应用于重组菌的筛选和鉴定。2. 质粒的不相容性常用于质粒的分类。基因工程中以质粒为载体进行基因克隆也是利用了质粒的不相容性原理。3.请介绍目前蛋白质组学研究中最常用的基本技术流程并简述其原理。蛋白质组学研究需要两条互补的实验工作流程 基于凝胶的工作流程（ Gel-based workflow）和基于液相色谱的工作流程（LC-based workflow）。在这两种流程中，基于凝胶的工

5、作流程是目前使用的较为广泛的、发展最为成熟的工作流程，通过样品制备、样品标记、双向电泳分离、图像获取、图像分析，到抠点、酶切、点靶和 MALDITOF 蛋白鉴定等一整套技术手段下来，如果还加上操作自动化，研究人员可以很方便的获得蛋白质性质数据。而基于液相色谱的工作流程则可以对在双向电泳中难以分离鉴定的高相对分子量、低相对分子量、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋白质进行有效的分离鉴定。这两种方法结合起来可以对复杂样品进行预分离、对低丰度蛋白进行富集，还可以完成蛋白酶解后多维液相分离（MDLC）。4.简述酵母双杂交技术的原理及其用途。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作

6、用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有 DNA 结合功能域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈

7、现完整的 GAL4 转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中：1.利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。2.利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用。3.利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响。4.利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）。第4章/第8章1. 分子克隆技术包括哪些基本步骤？分子克隆技术的基本步骤大致包括：目的基因的获取；载体

8、的选择；目的基因与载体连接；重组DNA导入受体细胞；重组体的筛选等；即分、切、接、转、筛等过程。2. 目的基因和载体连接主要有哪些方法？目的基因与载体构建成重组体的方法主要有：1）.粘性末端DNA分子的连接2）. 平末端连接法3）.通过同聚尾连接。 3. 简述分子克隆中常用的工具酶及其作用。在分子克隆技术中，常用的工具酶主要有：1.限制性核酸内切酶，它是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶；2.DNA聚合酶，它具有3种酶活性：1）53聚合酶活性；2）35核酸外切酶活性；3）53.反转录酶，其功能主要有：1）逆转录作用2）核酸酶H的水解作用3）依赖DNA的DNA聚合酶作用；4.D

9、NA连接酶，它在DNA重组中的主要功能是催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5磷酸基团与3羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组；5.碱性磷酸酶，它的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基团；6.末端脱氧核糖核苷酰转移酶，其功能主要有：1）在载体或目的基因 3末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。2）用于DNA 3末端的同位素探针标记；7.核酸酶S1，其作用是除去双链DNA的粘性末端以产生平末端、除去cDNA合成时形成的发夹结构以及分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况等。4.

10、 举例说明载体应具备的基本要素。载体应具备以下特征：1）能自我复制并具有较高的拷贝数，并有适宜的分子量，一般应.利用PCR-RFLP的技术进行诊断：基于AT的变换，改变了限制性内切酶的位点，因此在酶解正常人DNA和患者DNA后再用标记的珠蛋白基因为探针作Southern杂交时，就会出现不同的DNA条带。限制性内切酶Mst切割的序列是CCTGAGG（其中N是任何一种核苷酸），切割正常DNA产生1.15+0.20 kb 珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA时，由于AT破坏了Mst的位点（CCTGTGG），便形成1.35kb 珠蛋白的DNA片段；2.使用PCR-ASO进行诊断：PCR-ASO使用只有

11、几十个核苷酸的探针，检测被检DNA中的同源序列。由于探针比较短，当被检DNA序列与探针不完全互补，甚至只要有一个碱基的差异，杂交分子就不能稳定形成。已知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸探针，32P标记，进行Southern Blot 杂交/斑点杂交。2）、对地中海贫血进行基因诊断：.地中海贫血的基因诊断：基因不同程度的缺失引起不同类型的地贫，基因缺失14个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个 Gene时可得到10kb片段。.654地中海贫血的基因诊断：654地中海贫血是指发生在珠蛋白基因第二外显子第654位CT突变（IVS-654，CT）而引起的一种地中海贫血，该突变在IVS-第654位（nt654）上出现的单碱基取代产生了一个新的GT二核苷酸，联同旁侧序列构成一个新的5端异常的剪接位点，同时还激活了IVS-第579位（nt579）处3端隐匿的剪接位点，从而将IVS-2 nt589-nt652之间一段73bp内含子序列作为额外的外显子插入到外显子2和外显子3之间，产生了异常的-珠蛋白mRNA。在异常剪接的mRNA中存在一个提前的终止密码子，使翻译提前中止而产生截短的不稳定的异常珠蛋白，导致正常珠蛋白链合成减少。根据这一原理我们可以利用RT-PCR方法诊断这种类型的地中海贫血。