环境工程微生物学实验论文文档格式.docx

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这样循环，污水就得到净化，系统却能保持稳定。

另外，在废水处理中，观察微生物的形态，种类，也能了解到水的水质。

在我国，微生物技术是环境保护广泛应用和十分重要的技术，在水污染控制、大气污染治理、有毒有害物质的降解、清洁可再生能源的开发、废物资源化、环境监测、环境修复和污染源中的工业企业的清洁生产等方面，发挥着重要的作用。

现代微生物技术的发展，尤其是基因工程、细胞工程和酶工程等生物高技术的飞速发展和应用，是微生物处理具有更高的效率和更低的成本和更好的专一性，为微生物处理在环境保护中的应用展示了更为广阔的前景。

第一部分微生物的分离、接种与培养特征观察

1.实验目的

在土壤、活性污泥及生物膜等构筑物中，微生物都是以群体形式混杂在一起的，要了解微生物间的相互关系、降解机理及优势类群，故需要进行纯种分离。

1.1学会微生物技术实验中所用器皿的包装方法，了解其意义。

1.2掌握培养基和无菌水的制备方法

1.3掌握纯种分离技术和纯种接种方法。

1.4建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节

2.实验材料

2.1样品

水样（取自中山大学东校区河涌）

2.2仪器设备

2.2.1设备培养箱、冰箱、高压蒸气锅

2.2.2玻璃仪器三角瓶、试管、移液管、培养皿、烧杯

2.3培养基

营养琼脂培养基（细菌的培养与分离）

2.4其他无菌水、包装纸、酒精灯、硅胶塞、脱脂棉、打火机、线绳、记号笔。

3.实验方法

3.2仪器的包装

3.2.1目的

用牛皮纸或旧报纸进行包装，包好后可进行灭菌。

3.2.2洗涤与包装

3.2.2.1洗涤

装有固体培养基的培养皿，先将培养基用刮勺或其他工具刮下来，进行灭菌，待凝固后扔掉。

切记不可倒在水池中，以防堵塞下水道。

培养皿应先在2%煤酚皂液或0.25%新洁尔灭消毒液中浸泡24h或煮沸半小时，再用毛刷或海绵蘸着热洗涤剂（肥皂、洗衣粉或去污粉）水擦洗之后用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗二至三次，以皿壁上不挂水珠为净。

烘干或晾干（倒置于铁丝框内或空心格子木架上）备用。

用过的移液管要在石炭酸溶液中浸泡过夜，或经高压灭菌（1.05kg／cm2）30min后，再进行清洗。

清洗的方法是：

取一根橡皮管，将一端接在水龙头上，一端与吸管尖端连接，打开水龙头冲洗（若吸管末端塞有棉花，要先将其冲出），然后甩去水或空掉水，放于洗液中浸泡，数小时后取出，先用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，烘干备用。

3.2.2.2包装

三角瓶瓶口塞上硅胶塞，瓶口外包上2层到3层报纸，扎好灭菌。

每一支试管的管口都要塞上硅胶塞，四支试管为一组，在管口的外面包上两至三层报纸或，用线或橡皮筋扎好，然后灭菌。

通常以6～8套培养皿为一组，用旧报纸进行包装。

包好后准备灭菌。

吸管平头处塞1.5cm的棉花，松紧要合适。

将塞好棉花的吸管的尖端放在裁成4～5cm宽的长报纸条的一端，吸管与纸条约成45°

角。

折叠纸角，包住吸管尖端，然后以螺旋式在桌面上用力向前搓转，纸条将吸管包紧，余下的纸尾打成结（如图1）。

然后进行高温灭菌。

图1　移液管的包装

3.3灭菌方法

利用高压蒸汽灭菌法：

用高温加高压灭菌，不仅可杀死一般的细菌，对细菌芽胞也有杀灭效果，是最可靠、应用最普遍的物理灭菌法。

主要用于能耐高温的物品，如金属器械、玻璃、搪瓷、敷料、橡胶及一些药物的灭菌。

一般培养基、玻璃器皿、无菌水、无菌缓冲液、金属用具、接种室的实验服及传染性标本等都可采用此法灭菌。

高压蒸汽灭菌器的类型和样式较多，如：

①下排气式压力蒸汽灭菌器是普遍应用的灭菌设备，压力升至102.9kPa（1.05kg／cm2），温度达121～126℃，维持20～30分钟，可达到灭菌目的。

②脉动真空压力蒸汽灭菌器已成为目前最先进的灭菌设备。

灭菌条件要求：

蒸汽压力205.8kPa（2.1kg／cm2），温度达132℃以上并维持10分钟，即可杀死包括具有顽强抵抗力的细菌芽胞在内的一切微生物。

3.4分离方法

3.4.1稀释分离方法

本实验采用稀释分离法。

3.4.1.1倒平板。

通过吸取一份水样，用九份蒸馏水稀释，获得10-2、10-3、10-4浓度的三份稀释样品。

将6套培养皿按10-2、10-3、10-4编号，每个稀释度用2套培养皿（即两个平行样品）。

用1支1ml移液管按10-4、10-3、10-2由低浓度到高浓度的次序分别取0.5ml菌液注入相应编号的经灭菌后的培养皿中，以无菌操作取一定量的稀释液注入熔化好的保持在40~50°

左右的营养琼脂培养基（液高约为0.3cm），迅速在水平面上轻轻混匀，使培养基与稀释液充分混和，待凝固后置于培养箱中，在30℃恒温下倒置培养。

（如图2）

图2稀释倒平板和涂布法

3.4.1.2斜面培养。

将装好的试管培养基灭菌后，取出趁热斜摆在玻棒等物上，斜面长度在试管高度的1/3左右，凝固后即成斜面，共四份。

3.4.2涂布分离法

首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用灭菌的L型玻璃棒把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养后即可观察。

3.4.3划线分离法

最简单的分离微生物的方法是平板划线法。

用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。

划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

（图３）当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。

图3　平板划线分离法

1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法

3.4.4斜面接种法

主要用于经划线分离培养所获得的单个菌落的移种，以及观察细菌的某些培养特征。

以菌种移种为例，其接种方法是：

3.4.4.1取一菌种管和培养基管，置左手食指、中指、无名指间，拇指压住两管底部上侧面，使菌种管位于外侧，培养基管位于内侧。

3.4.4.2右手拇指和食指分别旋松两管棉塞。

火焰灭菌接种环。

3.4.4.3以右手小指与手掌，小指与无名指分别夹取棉塞（先外管后内管），将两管口迅速通过火焰1~2次。

3.4.4.4将已灭菌的接种环伸入菌种管中，从斜面上取菌少许，迅速伸入待接种的培养基管中，在斜面底部向上划一条直线，然后从底部起向上作曲折连续划线，直至斜面上方顶端。

3.4.4.5取出接种环，火焰灭菌管口，塞上棉塞（先塞内管）；

最后将接种环经火焰灭菌放好。

（如图4）

图4　斜面接种时的无菌操作

（1）接种灭菌

（2）开启棉塞（3）管口灭菌（4）挑起菌苔（5）接种（6）塞好棉塞

3.5培养方法

细菌37度倒置培养24-48小时；

真菌28-30度倒置培养3-5天

4.结果与分析

4.1细菌的分离结果

10-4

10-3

10-2

观察：

4.1.1梯度10-2与10-3及10-4的梯度均比较明显。

4.1.2平板计数

10-2浓度：

168个和182个。

平均175个。

10-3浓度：

42个和36个。

平均38个。

10-4浓度：

4个和6个。

平均5个。

4.1.3观察形态

4.1.3.110-2浓度：

菌落呈浅黄色，直径4mm，边缘呈花瓣状，有光泽，湿润，隆起厚度较大；

菌落呈橙黄色，直径3mm，边缘光滑，有光泽，湿润，隆起厚度较大；

4.1.3.210-3浓度：

菌落呈橙黄色，直径2mm，边缘光滑，有光泽，湿润，隆起厚度较大；

菌落呈灰白色，直径3mm，边缘光滑，无光泽，干燥，隆起厚度一般。

4.1.3.310-4浓度：

菌落呈橙黄色，直径3mm，边缘光滑，有光泽，湿润，隆起厚度较大；

菌落呈白色，直径2mm，齿状边缘，无光泽，干燥，隆起厚度较小。

5.分析

各菌落的不仅颜色、大小、边缘、隆起情况各异。

第二部分微生物的染色、鉴定观察

1.1了解微生物染色原理；

1.2学习微生物涂片染色操作技术；

1.3通过观察实验中分离出来的细菌的菌落特征及个体形态,为进一步鉴定菌种打下基础；

1.4通过革兰氏染色,区分哪些属于革兰式阳性细菌,哪些属于革兰氏阴性细菌,同时学习染色技术；

2.仪器与材料

由第一部分实验分离得到的细菌平板，革兰染色液，显微镜、载玻片、接种环、酒精灯等。

3.实验内容

用接种环挑取各种细菌进行涂片、革兰氏染色，然后进行镜检，观测革兰染色结果。

3.1革兰氏染色

3.1.1涂片在干净的载玻片中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧灼，冷却后，以无菌操作，挑取少量菌种于载玻片水滴中，混匀并涂成薄膜，注意涂布面积不要太大。

，自然干燥、固定。

3.1.2染色用草酸铵结晶紫染液染色1min，用水冲洗。

3.1.3媒染滴加革氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，用水冲去碘液。

3.1.4乙醇脱色斜置载片与一烧杯上，滴加95%乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停止（约0.5min）。

立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干。

脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。

若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；

而脱色不够时阴性菌被污染为阳性菌。

3.1.5复染番红复染染液复染1min，水洗。

3.1.6吸干并镜检用吸水纸吸走水滴，晾干后，用显微镜观察。

3.2显微镜的使用

3.2.1显微镜的安置置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘3～4cm，镱检时姿势要端正。

3.2.2调节光源安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镱采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜度调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。

3.2.3低倍镜观察将标本玻片置于载物台上，用标本夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10×

物镜，使其接过标本，用粗调节器（粗调螺旋）慢慢升起镜筒，出现图像后再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。

通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细观察。

3.2.4高倍镜观察在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，以聚光镜器光圈及视野进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。

3.2.5油镜观察在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高约2厘米，然后在待观察区域滴加1—2滴香柏油，将油镜转到工作位置，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。

3.2.6显微镜用后处理

3.2.6.1上升镜筒，取下载片。

3.2.6.2用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。

3.2.6.3用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。

3.2.6.4将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八字形”再向下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。

2.结果与分析

从显微镜上观察，细菌呈红色，应为革兰阴性细菌。

附：

革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。

实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。

碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。

当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。

革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

第三部分絮凝菌的筛选及性能测定

1.实验目的

分别用平板培养霉菌、酵母菌以及细菌（芽孢），然后斜面接种纯种细菌，再放入锥形瓶置于摇床培养，从而进行絮凝获得絮凝菌。

理解微生物的筛选概念，掌握微生物筛选方法。

2．仪器与材料

2.1培养皿、移液管、三角瓶、烧杯、量筒、漏斗、漏斗架

2.2牛皮纸、纱布、棉花

2.3玻璃珠、蒸馏水

2.4培养基：

营养琼脂培养基、发酵培养基

2.5高压蒸汽灭菌锅、摇床、烘箱、电炉、冰箱等

2.6其他药品：

4g/L高岭土悬浊液；

5mL％（wt％）CaCl2

3．实验内容

3.1平板培养阶段

3.1.1操作步骤

用锥形瓶取两份水样，水样A按一般倒平板方法，以PDA为营养培养基，作两个梯度的培养样品：

浓度分别为10-2和10-3。

所获菌种属于真菌类，主要是霉菌和酵母菌。

水样B进行85℃-90℃加热，然后以营养琼脂作培养基，培养的是细菌（芽孢）菌种。

3.1.2观察结果

水样A平板培养观察结果：

霉菌菌落大且有明显绒毛，酵母菌较霉菌小，外观类似细菌但比细菌大。

水样B平板培养观察结果：

细菌（芽孢）菌落呈白色，直径较大，在2cm左右，边缘不规则，扁平，较湿润，隆起不明显。

3.2斜面培养阶段

斜面培养是用于保存菌种，可弥补平板培养的深度不足、水分不足，提供较大的有效湿润面积以供细菌生长。

3.2.1操作步骤

在无菌操作下从平板培养样品B中挑取不同的菌落，后接种于斜面培养基上，以划S线的方式使菌种均匀分布在斜面上。

3.2.2结果观察

4.1摇床培养及絮凝性能测定阶段

4.1.1操作步骤

从斜面培养中挑取一环菌种，置于已装有发酵培养基的三角锥瓶中，把三角锥瓶放到摇床里进行30℃培养

在100ml量筒中加入93ml4g/l高岭土悬浊液，5ml1%CaCl2,2ml培养液，将量筒颠倒3-5次，目测，使高岭土悬浊液凝成较大絮状体的为有絮凝活性的菌株。

4.1.2观察结果

絮凝现象很微弱，说明絮凝活性非常微弱，不足以扩大培养成为絮凝菌团。

第四部分微生物应用实验-饮用水及空气学检验

1.1了解和学习大肠杆菌的测定原理和测定意义

1.2学习和掌握水中大肠杆菌群的检测方法及大肠菌群最可能数（MPN）检索表的使用

1.3学习空气中微生物的检验方法

液体培养基，营养琼脂培养基，恒温培养箱，灭菌培养皿，移液管，三角锥瓶等。

3．实验内容及方法

大肠杆菌群测定：

用含溴钾的液体培养基培养。

大肠杆菌群测定可显示水样是否受到粪便污染。

水中细菌总数测定：

用酒精搽拭水龙头灭菌，放水5min后取1ml水样，无菌操作将水样移至无菌培养皿内，再倾注3mm深的已熔化并冷却至45℃左右的琼脂培养基，迅速摇匀，凝固后倒置37℃培养24h。

水中细菌总数代表了水样中有机污染程度。

空气细菌总数测定：

将营养琼脂培养基倒入培养皿，打开盖子暴露空气中10min，再盖上皿盖，凝固后倒置培养。

4．实验结果及分析

原理：

大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，由于分解乳糖产酸能使紫色液体培养基变成黄色，且产生的气体能使液体中的小试管浮起。

阳性结果：

培养液颜色由紫色变为黄色（产酸）并且小试管内有气泡产生（产气）。

假阳性结果：

培养液颜色由紫色变为黄色（产酸），但小试管内没有气泡产生。

（存在产酸菌，但不是大肠杆菌群）

阴性结果：

培养液不变色，小试管内没有气泡产生。

大肠杆菌实验现象：

液体培养基颜色没有变化，小试管中没有气泡。

可认为水样中不存在大肠杆菌群。

空气细菌总数测定结果：

总数为128个水中细菌总数测定结果：

总数为84个

根据我国应用水卫生标准规定：

自来水1ml的总菌数不得超过100个。

由于大多数同学所测定的水中和空气中的细菌总数均较大，在操作均无误的前提下可以猜测是培养基灭菌不完全。

总结

通过对微生物进行分离、接种与培养特征观察，对微生物的染色、鉴定与显微个体观察，进行絮凝菌的分离与筛选和絮凝微生物性能试验，应用微生物检验饮用水及空气的卫生，我们逐步了解微生物的特性和形态，逐步学会利用微生物对各种样品进行检测的方法。

做实验需要有严谨和细心的精神。

在实验的绝大部分过程中，都需要无菌操作，即对与实验有关的——实验人的手，实验工具器具仪器，溶液等都需要进行严格的消毒灭菌。

如果因为不慎，便会造成其它细菌的感染，直接导致试验的失败。

微生物的实验除了让我们进一步深刻的了解微生物这一广泛分布在天地间的“清洁工”，初步了解微生物在环境工程领域的应用。

还培养了我们严谨认真的科学精神，只有拥有这些精神的人，才能在试验中获得正确的结果，才能学会在试验中不断探索，不断进取。