微生物学实验指导Word格式文档下载.docx
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一、课程的性质和任务
课程性质：
微生物学实验是一门大学本科的基础课实验。
微生物学实验的技术和方法已广泛渗透到生命科学的各分支领域,不断发挥其独特的作用。
特别是随着分子生物学的发展与拓宽，微生物学方法与技术显得尤为重要。
此外，医学、农学、林学等学科，甚至地质学、太空学等也需要微生物的方法与技术。
因此，熟悉掌握微生物学方法与技术，对其它学科的发展有直接的影响。
课程任务：
1.微生物学实验主要任务是使学生掌握研究与应用微生物的主要方法与技术，包括经典的、常规的、以及现代的方法与技术，使学生具有从事相关学科的基础理论研究与实际生产应用的微生物学实验技能。
2.与微生物学基础理论课紧密结合，使学生将理性知识与感性认识有机地结合，将书本知识用于实验，在实验中更深地理解基础理论，提高学生的综合能力与创新意识。
3.提高学生分析问题和解决问题的能力。
根据本学科的特点，逐步使学生认识微生物的基本特性，比较它们与其它生物的相似和不同之处，知道如何研究微生物以及对研究中所出现的问题进行分析，并加以解决。
二、教学要求与教学方法
1.教学要求
1）
注重微生物学基础实验技能的掌握与提高，克服盲目追求新颖而忽视基础的倾向；
2）
实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤；
3）
在实验中要有严紧的科学态度，尊重事实与实验结果，要善于发现新现象；
4）
树立密切合作的风气，包括学生与老师、班与班、组与组、组长与组员之间的紧密配合。
2.教学方法
以学生自己动手为主，老师在适当时间予以提示；
2）对实验中所出现的一些现象多向学生提出问题，使它们学会分析结果，并与理论知识有机结合；
根据实验的进行程度，引导学生更深入思考，逐步树立他们的创新意识；
4）严格要求使操作规范化，老师作示范，强调要点，学生自行练习。
三实验内容及课时安排
编号
实验名称
实验类型
课时
1
实验一油镜的使用及细菌显微形态的观察
验证性
3
2
实验二培养基的制备与灭菌
实验三环境中微生物的检测
4
实验四细菌的简单染色、革兰氏染色
5
实验五细菌特殊结构观察
6
实验六放线菌的形态观察
7
实验七真菌形态观察
8
实验八土壤微生物的分离与计数
9
实验九微生物大小的测定
10
实验十环境因素对微生物生长的影响
11
实验十一阿拉尔地区饮用水水质的微生物学检测
综合性
4
12
实验十二塔里木盆地荒漠土微生物区系分析
13
实验十三生物防治微生物的分离与筛选
设计性
合计
46
一、目的要求
1、理解显微镜油镜的使用原理，掌握显微镜油镜的使用方法；
2、了解细菌形态多样性。
二、基本原理
油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线发生折射或全反射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。
图1干燥物镜与油浸系统镜光线通路
三、实验器材
1、菌株
单杆菌、链杆菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、螺旋菌等。
2、仪器及其他
显微镜、擦镜纸、液体石蜡、乙醚、酒精
四、实验内容
以制备的各种细菌标本片包括杆菌（单杆菌、链杆菌）、球菌（双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌）、螺旋菌为材料观察细菌形态。
五、方法与步骤
油镜的使用
（1）先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将载物台下降）约2cm，并将高倍镜转出；
（2）在玻片标本的镜检部位加一滴液体石蜡；
（3）从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升（或镜筒下降），使油浸物镜浸入液体石蜡中，使镜头几乎与标本接触；
（4）从接目镜内观察，放大视场光阑及聚光镜上的虹彩光圈（带视场光阑油镜开大视场光阑），上调聚光器，使光线充分照明。
用粗调节旋钮将载物台徐徐下降（或镜筒上升），当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。
如油镜已离开油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，重复上述操作；
（5）观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚酒精混合液（乙醚2份，纯酒精3份），擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2～3下即可，（注意向一个方向擦拭）；
（6）将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不与载物台通光孔相对，而是成八字形位置，再将镜筒下降至最低，降下聚光器，反光镜与聚光器垂直，用一个干净手帕将接目镜罩好，以免目镜头沾污灰尘。
最后用柔软纱布清洁载物台等机械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。
六、注意事项
油浸物镜的工作距离很短，一般在0.2mm以内，再加上一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。
七、作业
1、绘制观察到的细菌的个体形态图；
2、根据操作体会，说明油镜在使用过程中需要注意哪些问题？
实验二培养基的制备及灭菌
一、实验目的
1、明确培养基配制的原理及方法，了解培养基中各成分的作用；
2、掌握高压蒸汽灭菌的原理和使用方法，掌握实验室常用物品的灭菌方法；
3、学会包扎吸管、培养皿，制作棉塞。
（一）培养基的制备原理
培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。
人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。
把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。
自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。
但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。
此外，培养基还应具有适宜的酸碱度（pH值）和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。
根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类。
按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。
根据培养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等。
培养基的类型和种类是多种多样的，必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配制，本实验分别配制常用培养细菌、放线菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基。
固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。
琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。
因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内（25℃～37℃）不会融化而保持固体状态。
（二）高压蒸汽灭菌原理
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。
导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：
一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；
三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ的热量。
这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
一般培养基用0.1MPa，121.3℃15～30min可达到彻底灭菌的目的。
灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。
1、药品
10％HCl,10%NaOH，牛肉膏蛋白胨培养基的配方药品；
高氏1号培养基的配方药品和马铃薯葡萄糖培养基的配方药品。
2、材料
具刻度1000mL搪瓷量杯，小铝锅，药匙，pH试纸，称量纸，漏斗架，试管架，纱布，棉花，牛皮纸，报纸，麻绳，标签纸，分装漏斗，培养皿，三角瓶，吸管，试管，量筒，烧杯，剪刀，乳胶管，玻璃棒等。
3、设备
电子天平、高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电磁炉、煤气灶、电炉等。
制备牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基及马铃薯葡萄糖培养基。
五、方法及步骤
1、称量
按培养基配方依次准确称量各药品放入大烧杯中。
注：
在称取牛肉膏时常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯，也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
蛋白胨很容易吸湿，在称量时动作要迅速。
另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一种药品。
瓶盖也不要盖错。
在制备高氏1号培养基时，先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全融化。
然后再称取其他各成分依次逐一溶化。
对微量成分FeSO4·
7H2O可先配置成高浓度的贮备液按比例换算后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4·
7H2O配成0.01g/mL，再在1000mL培养基中加1mL的0.01g/mL的贮备液即可。
2、溶化
在烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后在石棉网上加热溶解。
将药品完全溶解后，补充水到所需要的总体积，如配置固体培养基时，将称好的琼脂加入已溶解的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。
在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可以先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5％～2.0％的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热融化同时进行，节省时间。
在琼脂融化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。
同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。
配置培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基，影响细菌生长。
3、调pH
在未调节pH之前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果便酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至到要求的pH，反之用1mol/LHCl进行调节。
对于有些要求pH较精确的微生物，其pH调节可用酸度计进行。
4、过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些试验结果的观察。
一般无特殊情况下，这一步可以省去。
5、分装
按试验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。
装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。
在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞，造成污染。
6、加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞，以防止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。
7、包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水湿润棉塞，其外再用一道麻绳扎好。
用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。
三角瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。
8、灭菌
将上述培养基以0.103MPa，121℃，20min高压蒸汽灭菌。
手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤：
（1）首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
（2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。
注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。
三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。
再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
（4）用电炉加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除涡内的冷空气。
待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。
当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
本实验用0.1MPa，121.3℃，20min灭菌。
（5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。
（6）将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。
9、搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管口端搁置在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
10、无菌检查
将灭菌培养基放入37℃的培养箱培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。
11、无菌水准备
在试管或瓶内先盛以适量的蒸馏水〔或生理盐水O.9％NaCl），盖好棉塞，包上牛皮纸使其灭菌后，其水量恰为9mL。
每组准备10支与牛肉膏蛋白胨培养基可放在同一试管架上，以一大张牛皮纸包扎写上姓名，准备灭菌。
六、思考题
1、在配制培养基的过程中应该注意那些问题，为什么？
2、高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内的冷空气排尽？
灭菌结束之后，为什么要等压力降到“0”后才能打开放气阀？
3、灭菌在微生物实验中有什么重要意义？
了解微生物在自然界分布的广泛性，理解无菌操作的重要性。
平板培养基含有微生物生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在28～37℃温度下培养，2～4天内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。
每一种微生物所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。
因此，可通过平板培养基来检查环境中微生物的数量和类型。
三、实验内容
实验室环境及人体表面微生物的检测
四、器材
培养基平板，无菌水，灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯，酒精瓶，记号笔，废物缸，牙签等。
五、操作步骤
每组在“实验室”和“人体”两大部分中各选择一个内容做实验，或由教师指定分配，最后结果供全班讨论。
1、做记号
任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，培养皿的记号一般在皿底上。
如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。
用记号笔写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源，字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。
2、实验室微生物检查
（1）空气将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验的实验室，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中；
将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动的其他实验室，移去皿盖。
一小时后盖上两个皿盖。
（2）实验台和门的旋钮
a、用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间外画一垂直线。
b、取棉签左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞（或试管帽），将其取出，将管口很快地通过酒精灯的火焰，烧灼管口；
轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出放回棉塞（或试管帽），并将空试管放在试管架上。
c、弄湿棉签左手取灭菌水试管，如上法拨出棉塞并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞（或试管帽），并将灭菌水试管放在试管架上。
d、取样将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cm2的范围。
e、接种在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。
再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下），立即闭合皿盖。
将棉签放入废物缸。
f、划线另取接种环在火焰上灭菌，先将环端烧热，然后将接种环提起垂直放在火焰上，以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至可能碰到培养皿的部分，再移向环端，如此很快地来回通过火焰数次。
左手拿起平板，同样开启一缝，将灭过菌并冷却了的接种环，通过琼脂顶端的接种区，向下划线，直至平板的一半处。
注意：
接种环与琼脂表面的角度要小，移动的压力不能太大，否则会刺破琼脂。
闭合皿盖，左手将平板向左转动至空白处，右手拿的接种环再在火焰上烧灼，冷却。
接种环通过前面划的线条再在琼脂的另一半，从上向下来回划线到1/2处。
烧灼接种环，转动平板，划最后1/4，立刻盖上皿盖，烧灼接种环，放回原处。
整个划线操作均要求无菌操作，即靠近火焰，而且动作要快。
3、人体微生物的检查
（1）手指（洗手前与洗手后）
a、分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后，姓名、日期。
b、移去皿盖将未洗过的手指在琼脂平板的表面，轻轻地来回划线，盖上皿盖。
c、用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后，在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。
（2）头发在揭开皿盖的琼脂平板的上方，用手将头发用力摇动数次，使细菌菌降落到琼脂平板表面，然后盖上皿盖。
（3）咳嗽将去盖的琼脂平板放在离口约6～8㎝处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。
（4）牙垢
用灭菌牙签取牙垢按种在琼脂平板表面，然后盖上皿盖。
（5）皮肤参照
（2）的步骤操作。
4、将所有的琼脂平板翻转，使皿底在上，放37℃培养箱，培养1～2天。
5、结果记录方法
（1）菌落计数在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数。
不是划线的平板，也一分为四，数1/4面积的菌落数。
（2）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同的菌落类型。
但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离得很开的单个菌落。
菌落特征描写方法如下：
（a）大小大、中、小、针尖状。
可先将整个平板上的菌落粗略观察一下，再决定大、中、小的标准，或由教师指出一个大小范围。
（b）颜色黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。
（c）干湿情况干燥、湿润、粘稠。
（d）形态圆形、不规则等。
（e）高度扁平、隆起、凹下。
（f）透明程度透明、半透明、不透明。
（g）边缘整齐、不整齐。
五、实验报告
1．将实验结果记录于下表中。
样品来源
菌落数
（近似值）
菌落
类型
特征描写
大小
形态
干湿
高度
透明度
颜色
边缘
1
2
3
5
2、与其他同学所做的实验结果进行比较。
样品来源
菌落数（1/4平板）
菌落类型数（近似值）
3、比较各种不同来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？
4、人多的实验室与无菌室（或无人走动的实验室）相比，平板上的菌落数与菌落类型有什么区别？
你能解释一下造成这种区别的原因吗？
5、洗手前后的手指培养基平板，菌落数有无区别？
6、通过本次实验，在你防止培养物的污染与防止微生物的扩散方面，你学到些什么？
有什么体会？
实验四细菌的简单染色与革兰氏染色
1、学习细菌染色的原理和方法；
2、掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
三、实验
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