微生物学目的与要求.docx

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微生物学目的与要求

实验二细菌生理及外界因素对细菌的影响

目的

（一）掌握细菌的分离培养技术及纯种移种法。

掌握常用热力灭菌法及紫外线消毒灭菌法。

（二）熟悉细菌各种生长现象及细菌代谢产物及物理消毒法。

（三）了解细菌的常用培养基及生物因素对细菌的影响。

内容

（一）基础培养基的制备（自学），细菌移种（部分示教及操作）

（二）细菌生长现象（示教）

（三）分离培养方法——琼脂平板划线法（操作）

（四）细菌代谢产物的检查（操作及部份示教）

（五）常用物理消毒方法（操作）

（六）生物因素对细菌的影响（示教）

一、基础培养基制备及细菌移种

（一）基础培养基制备

1．肉汤培养基：

肉汤培养基常用瘦牛肉制成，如无牛肉用牛肉膏代替。

【材料】

牛肉、氯化钠、蛋白胨、氢氧化钠、蒸馏水。

【方法】

①称除去筋膜无油脂的瘦牛肉500克，用绞肉机绞碎后加水1000毫升，搅拌均匀后放置搪瓷锅内，置冰箱过夜，除去液面上的浮油并使牛肉的水溶性养料充分地渗透出来。

②次日取出，煮沸30分钟，用纱布过滤，肉渣中液体应尽量挤净。

③肉汤中加蛋白胨10克，氯化钠5g，搅拌加热使完全溶解，并用蒸馏水补足至1000毫升。

④冷至50℃左右，用氢氧化钠校正pH至7.6左右。

⑤酸碱度调整后，加热10分钟，使肉汤中部分蛋白质及磷酸盐等因加碱与再度加热的影响，而重新凝固沉淀。

滤纸过滤，补足失水。

重新调整酸碱度。

⑥分装于烧瓶或试管，瓶口或管口加棉塞，包扎后置高压蒸汽灭菌器材内，121℃蒸汽灭菌15~20分钟。

冷却，贴好标签，置于燥凉处备用。

注：

如用牛肉膏制备肉汤培养基，配方如下：

牛肉膏0.5g

蛋白胨1g

氯化钠0.5g

蒸馏水100ml

以上各种成份混合加热溶解后，即可调整pH，分装灭菌待用。

2．肉汤琼脂固体培养基制备

加2~3克琼脂至100毫升肉汤培养基内。

加热融化，过滤，补足失水，分装于试管中。

高压蒸汽灭菌后，趁热将试管斜置，冷凝后即成琼脂斜面培养基。

或待冷至50～60℃，以无菌操作倾入灭菌的培养皿中，冷凝后即成琼脂平板。

图2-1制作琼脂平板法

3．肉汤琼脂半固体培养基制备

①加入琼脂0.35克至100毫升pH7.8的肉汤中，加热融化后，用脱脂棉过滤，补足失水。

②分装于小试管（10×100毫米），每管3毫升。

高压蒸汽下121℃灭菌15~20分钟后直立冷凝即成。

（二）纯种细菌接种法

1．斜面培养基接种法（示教）

【材料】

（1）菌种：

大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物。

（2）培养基：

琼脂斜面培养基。

【方法】

（1）左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种与待接种的培养基管（图2－2），使菌种管位左，培养基管位右，斜面部均应向上，勿成水平，以免管底凝结水浸润在培养基表面甚至沾湿棉塞。

图2-2斜面培养基接种法

（2）右手拇指和食指分别转动两管棉塞，以便接种时易于拔取。

（3）右手执持接种环（姿势与握铅笔似），在火焰中烧红灭菌，欲伸入试管内的接种杆部分亦要迅速通过火焰2~3次以烧去其表面的杂菌。

灭菌过的接种环要握持手中，勿再碰及它物。

（4）以右手手掌与小指，小指与无名指分别拔取并挟持两管棉塞，将两管管口迅速通过火焰数次灭菌。

（5）以灭菌并已冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑取菌苔少许。

退出菌种管，再伸进待接种的培养基管，自斜面底轻轻向顶蜿蜒划线或在斜面作上下涂布，慎勿划破培养基表面（图2－3）。

沾菌的接种环，进出试管时，均不应触及试管内壁。

（6）接种毕，重新烧红接种环灭菌后放下。

两管管口迅速通过火焰2~3次，塞回棉塞并以右手拇、食两指分别将两管棉塞转进至原来位置。

37℃孵育18~24小时后观察生长情况。

图2-3斜面培养基蜿蜒划线法（左）及上下涂带法（右）

2．液体培养基接种法（示教）

【材料】

（1）菌种：

大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物。

（2）培养基：

肉汤培养基。

【方法】

（1）如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的肉汤管。

（2）接种环灭菌冷却后，伸入菌种管挑取少量菌苔退出菌种管，再伸入肉汤管。

在接近液面的管壁上轻轻磨研，再沾少许肉汤调和，使菌混合于肉汤中（图2－4）。

（3）接种完毕，接种环重行灭菌后放下。

塞好棉塞，37℃孵育18~24小时后观察生长情况。

图2-5半固琼脂培养基接种法

图2-4液体培养基接种法

3．穿刺接种法（半固体接种法）示教

【材料】

（1）菌种：

大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物。

（2）培养基：

半固体琼脂培养基。

【方法】

（1）如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的半固体琼脂培养基。

（2）右手握接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔。

垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近（但勿触及）试管底，然后循原路退出（图2－5）。

二、细菌的生长现象（示教）

【材料】

1．菌种：

大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物

枯草杆菌琼脂斜面18~24小时培养物

甲型链球菌血琼脂斜面18~24小时培养物

变形杆菌琼脂斜面18~24小时培养物

痢疾杆菌琼脂斜面18~24小时培养物

2．培养基

普通肉汤培养基、血清肉汤培养基

琼脂平板、琼脂斜面、半固体培养基

【方法】

1．将大肠杆菌、枯草杆菌分别接种于2支普通肉汤培养基；甲型链球菌接种于血清肉汤培养基，37℃孵育18~24小时后取出，观察结果。

2．将变形杆菌、痢疾杆菌分别接种于2支半固体培养37℃孵育18~24小时后取出，观察结果。

3．将大肠杆菌接种于琼脂平板及琼脂斜面培养基，37℃孵育18~24小时后取出，观察结果。

三、分离培养法——板划线法（操作）

【材料】

（1）菌种：

葡萄球菌和大肠杆菌的混合菌液。

（2）培养基：

琼脂平板。

【方法】

1．烧灼接种环，待冷（约等待1分钟左右），取一接种环混合菌液。

2．左手抓握琼脂平板培养基（皿盖留在桌上），使尽量直立，以免空气中杂菌落入，并靠近火焰周围。

右手握持沾菌的接种环在琼脂平板上端来回划线，涂成一薄膜（约占平板总面积的1／10）。

划线时使接种环面与平板表面成30~40度角轻轻接触，以腕力在平板表面作轻快的滑移动作，接种环不应嵌进培养基内。

3．烧灼接种环，以杀灭环上留剩的菌液。

待冷（环是否冷却？

可先在平板培养基的边缘空白处接触一下，若琼脂溶化表示尚未冷却，宜再稍等复试之）将环通过薄膜处作连续划线（约占平板的1／5~1／6），划毕再用火焰灭菌。

冷后作同样的划线，共计4~5次（图2-6、7）。

4．划线完毕，将琼脂平板培养基覆盖皿盖，并在培养皿底玻璃面，用记号笔

注明接种菌名，接种者姓名及班级、日期等（以后凡接种的培养皿、试管等，均要照此要求，用记号笔注明）。

将培养皿倒置放进孵育箱培养，这样可避免培养过程中凝结水自皿盖滴下，冲散菌落。

5．37℃孵育24小时后取出，观察琼脂平板表面生长的各种菌落，注意其大小、形状、边缘、表面结构、透明度、颜色等性状。

图2-7孵育后菌落的分布情况法

图2-6平板划线法

四、细菌代谢产物的检查

（一）单糖发酵试验（示教）

【原理】

不同细菌具有不同的糖分解酶，故分解各种糖后的产物也不相同，有的产酸，有的尚有气体形成，借此可鉴别各种细菌。

单糖发酵试验在肠道病原菌的鉴定中尤其重要。

单糖发酵管是将葡萄糖、乳糖或麦芽糖等加入蛋白胨水培养基内，使其最终浓度为0.75~1％，并加入一定量的指示剂及一只小倒管。

接种细菌并孵育一定时间后，若该菌具有分解某种糖的酶，分解产酸就会使指示剂变色。

如指示剂为酸性复红则变为红色；溴甲酚紫则呈黄色。

若有气体形成，则小倒管内有气泡集聚。

【材料】

1．菌种；大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌琼脂斜面。

2．培养基：

乳糖发酵管。

【方法】

将大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种于3支乳糖发酵管，37℃孵育18~24小时，取出观察并记录结果。

（二）（Voges—Proskauer）试验（操作）

【原理】

VP试验可鉴别大肠杆菌和产气杆菌。

两菌在糖代谢中，分解葡萄糖后都能产生丙酮酸；丙酮酸进一步分解形成甲酸、乙酸、乳酸等。

产气杆菌并可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇，在碱性环境下被空气中氧气氧化为二乙酰，后者与蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，此为VP试验阳性。

在试验中加入α-萘酚，可加速这个反应。

大肠杆菌不能将丙酮酸脱羧故VP阴性。

2CH3COCOOH（丙酮酸）CH3COCHOHCH3（乙酰甲基甲醇）

-2H

+KOH

CH3COCHOHCH3CH3COCOCH3（二乙酰）

NH2N－C－CH3

CH3COCOCH3＋HN－C（胍）NH－C（红色化合物）＋2H2O

NH2N－C－CH3

【材料】

1．菌种：

大肠杆菌、产气杆菌斜面18~24小时培养物。

2．培养基：

葡萄糖蛋白胨水培养基。

3．40％KOH溶液（含0.3％肌酸）、6％α-萘酚酒精溶液，毛细吸管。

【方法】

1．分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支葡萄糖蛋白胨水培养基中。

2．37℃孵育48小时后取出分别加入1毫升KOH和α-萘酚溶液，摇匀。

静置桌上5~15分钟内出现红色者，为阳性反应。

（三）甲基红（M．R）试验（操作）

【原理】

本试验可鉴别大肠杆菌和产气杆菌。

产气杆菌能将两分子的丙酮酸脱羧生成一分子的中性乙酰甲基甲醇，故培养物中形成酸类较少，pH值在5.4以上。

因此加入指示剂甲基红（MethylRed）后，呈现桔黄色，此为甲基红试验阴性。

而大肠杆菌分解丙酮酸，产生酸类较多，pH在4.5或更低，故甲基红呈现红色（阳性）。

【材料】

1．菌种：

大肠杆菌、产气杆菌斜面18~24小时培养物。

2．培养基：

葡萄糖蛋白胨水培养基

3．甲基红

【方法】

1．分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支葡萄糖蛋白胨水培养基中。

2．37℃孵育2—3天取出，分别滴加甲基红试剂2~3滴后立即观察。

阳性者呈红色，阴性者呈黄色。

（四）枸橼酸盐利用试验（操作）

【原理】

枸橼酸盐培养基中仅含无机盐及唯一有机物枸橼酸盐．一般细菌能利用磷酸二氢铵作氮源，但不一定能分解枸橼酸盐取得碳源，因此根据能否利用枸橼酸盐可鉴别不同细菌。

产气杆菌可以利用枸橼酸盐作为碳源，就能在本培养基上生长，形成菌落。

且分解后，有碱性的碳酸盐生成，使培养基的pH值（原在7.0以下）升高，转为碱性，则溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。

大肠杆菌不能分解枸橼酸盐，得不到碳源，不能生长，指示剂也就不会变色，培养基仍为原来绿色。

【材料】

1．菌种：

大肠杆菌、产气杆菌斜面18~24小时培养物。

2．培养基：

枸橼酸盐培养基．

【方法】

1．分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支枸橼酸盐培养基上。

2．37℃孵育24小时后观察。

有菌苔出现，培养基颜色变为深蓝色者，是为枸橼酸盐利用试验阳性。

（五）吲哚（Indol）试验（操作）

【原理】

有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚（靛基质）。

吲哚无色不能直接察见，加入对二甲基氨基苯甲醛试剂（吲哚试剂），作用后能形成红色的玫瑰吲哚，则被肉眼所识别。

【材料】

1．菌种：

大肠杆菌、产气杆菌斜面18~24小时培养物。

2．培养基：

蛋白胨水培养基。

3．试剂：

吲哚试剂、乙醚。

【方法】

1．分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支蛋白胨水培养基中。

2．37℃孵育48小时后取出，每管加2~3滴吲哚试剂于液面上，在接触面呈玫瑰红色（环状）者为阳性；仍呈黄色者为阴性。

若颜色不明显，可加4~5滴乙醚至培养物中，摇匀，使乙醚分散至培养物中。

将培养物静置桌上，待乙醚小滴上升至培养物液面后，再