壳寡糖衍生物Word格式文档下载.docx
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稻瘟病和纹枯病是水稻的重要病害，在世界范围内每年造成上亿千克产量损失，高发病时甚至可以造成减产50%。
Obara等[5]用固相微萃取技术和GC-MS法分析不同诱导剂释放的挥发物作为诱导剂处理稻瘟病菌Pyriculariaoryzae，将病菌嫁接到水稻叶片上（含有壳寡糖），发现不同的诱导剂产生的挥发物在定性和定量上有一些差别。
Inui等[6]将一系列浓度的壳寡糖放到水稻培养液中，也发现其能够诱导苯丙氨酸解氨酶（PAL）。
胡健等[7]结果表明：
相对分子质量不同的壳寡糖对供试水稻品种叶片几丁质酶的诱导作用不同，相对分子质量为1500的壳寡糖诱导效果最佳，而相对分子质量为500的壳寡糖诱导效果最差。
不同水稻品种对纹枯病的抗性不同，其几丁质酶的诱导能力也不同，无论是苗期还是抽穗期，抗病能力强的水稻品种，几丁质酶的诱导水平也高。
宁伟等[8]对30株水稻幼苗发病情况的统计结果显示，经5μg·
mL-1壳寡糖处理的水稻植株抗稻瘟病能力明显增强，病斑级数为2～3级，植株抗病级数为1～2级；
而未经壳寡糖处理的植株极大部分病斑为感病病斑，发病级数在4～5级。
（3）对胡萝卜的诱导抗性
Chris等[9]利用链霉菌N-174壳聚糖酶制备了平均聚合度为7的（质量浓度为0.2%）的壳寡糖，并用其处理收获后的胡萝卜，针对其核盘霉菌，测量了它的抑制系数。
发现核盘霉菌在马铃薯琼脂上呈放射状生长，这使得胡萝卜在放置3d以上时就开始腐烂。
但当在零度或使用壳寡糖处理后，就能够诱导胡萝卜对核盘霉菌产生抗体。
（4）对番茄的诱导抗性
Noah等[10]研究了5%或30%乙酰化程度的几丁质、壳寡糖和壳聚糖对番茄Lycopersiconesculentum叶片中水解酶的诱导情况，发现乙酰化程度低的壳寡糖没有诱导作用，而95%乙酰化的壳寡糖是一个有效的抗病诱导剂。
何培青等[11]研究了0.3%壳寡糖诱导番茄叶片120h后，其挥发性物质对番茄枯萎病菌Fusariumoxysporum孢子萌发和菌丝生长的影响，采用气相色谱-质谱联用技术，检测诱导后番茄叶中挥发性物质及植保素日齐素质和量的变化。
结果表明，经壳寡糖诱导后，番茄叶中挥发性物质对病菌的抑制率较对照组高。
番茄叶中挥发性抗真菌物质的总含量为对照组的1.49倍；
氧合脂类、萜类及芳香类化合物的含量分别提高了61%、10%和69%，其中（E）-2-乙烯醛的含量增加了64%，水杨酸甲酯的含量增加了38%。
（5）对棉花的诱导抗性
郭红莲等[12]研究发现，壳寡糖可以诱导棉花细胞活性氧代谢发生改变。
他们以不同浓度壳寡糖为激发子，均可诱导棉花悬浮细胞的活性氧迸发，其峰值出现时间都在20～30min左右；
此外，壳寡糖还可以诱导棉花细胞中活性氧清除酶系活性的变化，SOD和CAT活性变化的最大值在处理后60～90min左右。
浓度不同的壳寡糖在诱导趋势变化上却相似。
他们[13]以壳寡糖诱导处理细胞，加入终浓度分别为0.05mmol/L的LaCl3和三氟乙酸（TFA），处理过程中细胞保持在悬浮状态。
研究表明，壳寡糖可诱导棉花细胞苯丙氨酸解氨酶（PAL）和超氧化物歧化酶（SOD）活性增加，钙信使系统参与壳寡糖对棉花细胞的诱抗作用。
（6）对小麦的诱导抗性
日本京都大学IshiharaAtsushi[14]用壳寡糖测试燕麦时，发现其能够诱导燕麦HTT酶的活性，从而诱导其产生抗病能力。
刘晓等[15]用壳寡糖和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）以不同方式处理小麦种子，测定其从G1期启动进入S期和G2-M期的胚细胞百分率和小麦黄化苗的生长，结果表明，壳寡糖可促进小麦种子胚细胞周期启动并促进小麦根数目增加，说明壳寡糖对小麦种子的胚细胞分裂有促进作用。
壳寡糖预处理小麦种子可解除DON对小麦黄化苗生长及胚细胞启动的抑制作用，表明寡聚糖可提高植物对病原菌毒素的抗耐性，这可能是寡聚糖诱导植物提高抗病性的重要机制之一。
Takezawa[16]用小麦培养的细胞来研究Ca2+的传递作用和诱导细胞对真菌病原体的抵抗作用。
以typhulaishikariensis衍生的物质来诱导用小麦培养的细胞，结果显示，ccd-1基因密码是一个14kDa的Ca2+-蛋白质复合物，它具有一个偏酸性的两性分子特征。
壳寡糖诱导显示了它能够转换Ca2+信号，这能使植物启动自己的防御体系，免受真菌的入侵。
（7）对草莓的诱导抗性
郭红莲等[17]以草莓悬浮培养的细胞为对象，研究了壳寡糖处理对活性氧代谢的效应。
结果表明，壳寡糖可诱导草莓悬浮培养细胞的活性氧迸发，其峰值出现于20～30min，同时也可诱导活性氧清除酶活性上升，SOD和CAT活性的最大值出现在处理后60～90min。
此外，他们还研究了壳寡糖与草莓的结合过程[18]。
（8）对油菜的诱导抗性
陆引罡等[19]以壳聚糖酶降解壳聚糖而得的壳寡糖为基本成分，配以化肥、微量元素及防腐剂等成分，混合调制成较稳定的胶体溶液后拌种，发现其对油菜种子发芽和出苗均无显著影响，但可促进油菜生长，提高壮苗率，增加产量，增产幅度在4.3%～9.7%，其增产以增加每角果粒数为主。
壳寡糖拌种可明显抑制油菜菌核病的发生，对3个油菜品种的防治率分别为34.19%～44.10%。
室内测定结果发现，用较高浓度的壳寡糖（0.5～0.75mg·
mL-1）拌种，其对油菜菌核病菌菌丝生长有抑制作用，表明壳寡糖对油菜菌核病菌有诱导抗性。
1.1.2在医疗领域中的应用
壳寡糖具有多方面生理功能以及抗肿瘤效果。
早在1985年，Suzuki等就用甲壳六聚糖对小鼠进行抗肿瘤测试，得到了明显效果；
1997年，王中和等又用低分子壳多糖口服液对临床患者进行辅助治疗，发现白细胞、淋巴细胞的总数保持稳定，T淋巴细胞的数量显著上升，也说明了低分子壳多糖的抗肿瘤辅助疗效。
因此，它可作为早期肿瘤的治疗药物。
其作用机理为[20]：
N-乙酰-D糖胺（GlcNA）或D-糖胺（GLcN）残基与巨噬细胞表面受体结合后，激活巨噬细胞释放IL-1，同时引起T细胞表面IL-2受体表达，而这又加速了T细胞成熟而释放IL-2，IL-2与受体结合后，进一步加速T细胞分化成熟为细胞毒性T细胞，从而产生抗肿瘤作用。
溶菌酶作为消炎剂在医药上应用广泛，在食品中用作防腐剂在动物的血和尿中也含有一定量的溶菌酶，所以溶菌酶可以作为检验某种病患的一个指标。
人体血液和尿中含溶菌酶，患者比正常人含该菌酶高。
有人选取甲壳四聚糖并与对-硝基苯酚合成，产生发色基团，可作为临床诊断试剂，快速而简便，可在医学、畜牧中应用。
Nanjo等用甲壳五糖合成了衍生物P-硝基酚五（N-乙酰基）β-壳寡五糖，用作溶菌酶培养基，结果表明比四糖作为发色基团效果更好。
1.1.3在食品和化妆品领域中的应用
几丁寡糖具有柔和甜味，可作为素材加以利用。
壳寡糖也具有增强人体免疫力的作用，有希望在改善食品结构，提高食品保水性能方面有重要作用。
另外，甲壳低聚糖在食品中还有一定的抗菌作用[21]，研究结果表明相对分子质量为1500的壳寡糖，质量浓度1g·
L-1pH6.0时，其抑菌效果很好，但pH>
6.0时，其抑菌率开始减小并有所下降。
而相对分子质量为440000的壳聚糖，质量浓度为2.5g·
L-1时，在pH5.2以下，抑菌作用基本上与1g·
L-1的甲壳低聚糖相当。
它的作用机理有报道说，低分子量壳聚糖能使DNA转录受阻，从而显示出抗菌性影响细菌繁殖。
甲壳低聚糖作为化妆品材料[22]，效果很好，首先甲壳质的超微粉末可加速其渗透作用；
其次，壳寡糖盐的水溶液可改善皮肤和毛发的保湿功能且具有很强的抑菌性，邵健、杨宇民在低聚氨基葡萄糖的吸湿、保湿和抑菌性质一文中对此作了很好的说明；
再次，水溶性甲壳质衍生物可开发出皮肤护理剂、毛发加工保护剂和防晒剂。
1.2壳寡糖及其衍生物的应用展望
除了不能与碱性农药混合使用外，壳寡糖是一种良好的生物源农药，具有对环境无污染，能够诱导植物产生抗病性等优点。
而植物诱导抗病性具有抗病谱广、持续时间较长、可控的抗病性表达时间和空间等特点，这些特点决定了壳寡糖在植物诱导抗病性方面具有广阔的应用前景。
高等植物的诱导抗病性从激发子与受体识别开始，到植物产生明显的抗病防卫反应结束，在这一过程中，壳寡糖激发子诱导的防卫反应信号是多途径的，研究其信号转导的过程将增进人们对植物防卫反应的认识。
但壳寡糖诱导的抗性信号转导细节、在细胞表面的受体、诱导抗性基因的克隆、防御基因的调控方式等方面仍需深入研究。
目前，中国科学院大连化学物理研究所研制的壳寡糖生物农药已获得国家农业部农药临时登记证，并与相关企业联合，在农业生产进行大面积推广，取得了明显的经济和社会效益。
相信随着研究的进一步深入，壳寡糖诱导的植物抗病性的作用机理将逐渐被了解，同时也可为植物抗病基因工程奠定理论基础，壳寡糖及其衍生物的应用前景将会更加广阔。
1.3研究方向与思路
经过生物降解的低分子量壳寡糖具有广谱的杀菌作用，但与其他化学合成的杀菌剂相比，其抗菌活性较低，因此拟在壳寡糖分子中引入一个抗菌活性骨架，来进一步提高其抗菌活性。
经初步研究，苯并吡喃甲酸对多种植物病原菌具有良好的杀菌效果，因此本实验从壳寡糖出发与苯并吡喃类衍生物甲酸脱水缩合得到3种苯并吡喃基壳寡糖衍生物，利用IR、UV等对化合物进行了结构表征。
2实验部分
2.1试剂与仪器
表2.1主要化学试剂一览表
试剂名称
分子式
规格
来源
三氟乙酰乙酸乙酯
CF3COCH2COOCH2CH3
AR
北京化学试剂公司
5-NO2水杨醛
C7H5NO2
5-氯水杨醛
C7H5O2Cl
3、5-二氯水杨醛
C7H5o2Cl2
壳寡糖
上海海曲化工有限公司
乙腈
CH3CN
色谱纯
天津赛孚瑞科技有限公司
TBTU
吉尔生化（上海有限公司）
DMSO
CH3SOCH3
天津恒兴化学试剂制造有限公司
无水乙醇
C2H6O
天津市德恩化学试剂有限公司
三乙胺
N（CH2CH3）3
天津市福晨化学试剂厂
石油醚
氢氧化钠
NaOH
开封市芳晶化学试剂公司
甲醇
CH3OH
表2.2主要使用设备一览表
名称
生产厂家
RE-52AA旋转蒸发仪
上海亚荣生化仪器厂
SHB-3循环水多用真空泵
郑州杜甫仪器厂
CL-2型恒温磁力加热搅拌器
郑州长城科工贸有限公司
ZF-Ⅰ型三用紫外分析仪
上海顾村电光仪器厂
X-4数字显示显微熔点仪
北京泰克仪器有限公司
FT-IR200型红外光谱仪
ThermoNicolet公司
BS110电子天平
德国SARTORIU
安捷伦1200型高效液相色谱仪
安捷伦公司
2.2合成与分析
2.2.1苯并吡喃类甲酸酯
a：
R1=Cl,R2=Hb:
R1=NO2,R2=H;
c:
R1=Cl,R2=Cl
在冰水浴的条件下向干净的圆底烧瓶中依次加入12mmol三氟乙酰乙酸乙酯,10mmol水杨醛无水乙醇3mL哌啶8滴，放入搅拌磁子，进行密闭搅拌。
待有淡黄色物质出现继续反应12小时，将无水乙醇利用旋转蒸发仪尽量除去。
使其自然冷却后加入适量石油醚放入冰箱内结晶洗出，将产物用石油醚洗涤减压抽滤得白色粗产物，用乙醇重结晶得较纯产品，计算产率。
2.2.2苯并吡喃类甲酸的合成
在100mL的圆底烧瓶放入10mmol化合物2a，用甲醇溶解，约用甲醇18mL，再加入5mol/L的NaOH3.0mL,磁力搅拌，添加回流装置，回流4h，自然冷却后用6mol/L的HCl调pH值约等于2，出现白色固体，减压抽滤，用蒸馏水洗涤，后用乙醇进行重结晶，烘干称重，计算产率。
2.2.3苯并吡喃基壳寡糖新衍生物
在干净的100mL的圆底烧瓶中依次加入1mmol壳寡糖，苯并吡喃甲酸8mmol，TBTU12mmol，三乙胺22.4mmol,乙腈15mL，DMF2.5mL，进行常温搅拌24h。
将产物用无水乙醇进行洗涤减压抽滤，。
将粗产品用甲醇进行索式提取得较纯产品。
2.2.4红外光谱分析
取纯净的化合物约2mg，干燥的KBr200mg，置于玛瑙研钵中，混合均匀，研成粉末。
取适量混合物转移至压片磨具中，加压成透明或半透明薄片，置于红外分光光度计中检测，测试范围4000~400cm-1。
3结果与分析
3.1苯并吡喃类衍生物酯和酸的结构表征
表3.1化合物（2a-2c）和（3a-3c）的物理常数
化合物
R1
R2
形态
熔点/℃
产率/%
2a
Cl
H
白色晶体
115.5-116.9
70
2b
NO2
109.8-110.8
65
2c
129.6-131.3
51
3a
279.9-281.7
85
3b
176.2-178.1
80
3c
191.6-192.4
75
3.1.1液相分析
苯并吡喃类衍生物酯和酸的液相光谱吸收见图3.1、3.2、3.3。
所用溶剂是甲醇和水，其速度分别是0.7mL/min,0.3mL/min。
（１）氯代苯并吡喃甲酸酯和酸的液相光谱图
图3.1氯代苯并吡喃甲酸酯的液相光谱
图3.2氯代苯并吡喃甲酸的液相光谱
有图可知氯代苯并吡喃甲酸酯出峰时间是7.123min,而氯代苯并吡喃甲酸的出峰时间1.574min。
（２）硝基苯并吡喃甲酸酯和酸的液相光谱图
图3.3硝基苯并吡喃甲酸酯的液相光谱
图3.4硝基苯并吡喃甲酸的液相光谱
硝基苯并吡喃甲酸酯的出峰时间是4.958min，硝基苯并吡喃甲酸的出峰时间是一分钟多。
（3）3，5-二氯苯并吡喃甲酸酯和酸的液相光谱
图3.53，5-二氯苯并吡喃甲酸酯的液相光谱
图3.63，5-二氯苯并吡喃甲酸的液相光谱
3，5-二氯苯并吡喃甲酸酯的出峰时间是12.595min，3，5-二氯苯并吡喃甲酸酯的出峰时间是一分钟多。
3.1.2红外吸收分析
（1）氯代苯并吡喃甲酸酯和硝基、3，5-二氯苯并吡喃甲酸酯的红外吸收图谱分别见图3.7、3.8、3.9.同时以氯代苯并吡喃甲酸酯的红外吸收图谱为例证实了酯的结构。
图3.7氯代苯并吡喃甲酸酯的红外吸收图谱
图3.8硝基苯并吡喃甲酸酯的红外吸收图谱
图3.93,5-二氯苯并吡喃甲酸酯的红外吸收图谱
化合物（2a~2c）的红外图谱分析见表3.2
表3.2化合物（2a~2c）的红外图谱
VO–H/cm-1
VAr-H/cm-1
VCH3/cm-1
VC=O/cm-1
VAr/cm-1
3314
3053
29871395
1700
163615641467
3426
3068
29851375
1721
161915711478
3311
3080
29871372
163315601459
以（2a）为例进行分析：
3314cm-1是羟基的伸缩振动吸收峰，3053cm-1是苯环、双键上的C-H伸缩振动吸收峰,2987cm-1，1395cm-1是饱和脂肪烃甲基的伸缩振动吸收峰与弯曲振动吸收峰，1700cm-1是羰基的伸缩振动吸收峰，1636cm-1，1564cm-1，1467cm-1是苯环的骨架振动吸收峰。
化合物2a的红外图谱见图3.7。
（2）氯代苯并吡喃甲酸和硝基、3，5-二氯代苯并吡喃甲酸的红外吸收图谱分别见图3.10、3.11、3.12。
同时以氯代苯并吡喃甲酸的红外吸收图谱为例证实酯确实进行了水解，并进一步证明了酸的结构。
图3.10氯代苯并吡喃甲酸的红外吸收图谱
图3.11硝基苯并吡喃甲酸的红外吸收图谱
图3.123,5-二氯苯并吡喃甲酸的红外吸收图谱
化合物（3a~3c）的红外图谱分析见表3.3。
表3.3化合物（3a~3c）的红外图谱
VO–H/cm-1
VC=C-H/cm-1
3369
3106
3043
1670
161715651480
3416
3089
2973
1679
162615221496
3417
3074
2956
1746
163415621463
以（3b）为例进行分析：
3416cm-1是羟基的伸缩振动吸收峰，2956cm-1,3074cm-1是苯环、双键上的C-H伸缩振动吸收峰,1746cm-1是羰基的伸缩振动吸收峰，1634cm-11562cm-11463cm-1是苯环的骨架振动吸收峰。
化合物3b的红外图谱见图3.11。
3.2苯并吡喃基壳寡糖衍生物的结构表征
3.2.1紫外吸收分析
图3.13壳寡糖（COS）与苯并吡喃基壳寡糖衍生物的紫外吸收光谱
由壳寡糖（COS）及苯并吡喃基壳寡糖衍生物紫外吸收光谱数据（表3.4）可以看出：
COS在265nm处有1个强的吸收峰，在大于268nm波长范围无明显吸收。
苯并吡喃基壳寡糖衍生物在200~327nm处各有三个吸收峰。
苯分子在180~184nm,200~204nm有强吸收带E1和E2带，在230~270有弱吸收带B带。
由于含有π键的生色团与苯环相连，π→π*共轭使苯环的三个吸收峰发生明显红移。
紫外图谱显示与理论推断相符。
表3.4壳寡糖（COS）与苯并吡喃基壳寡糖衍生物的紫外吸收光谱数据
化合物UV/nmUV/nmUV/nm
壳寡糖（COS）265
氯代苯并吡喃基壳寡糖322274201
硝基代苯并吡喃基壳寡糖327275202
3，5-二氯苯并吡喃基壳寡糖334267208
从表3.4可以看出，苯并吡喃基壳寡糖衍生物的紫外光谱扫描曲线与壳寡糖（COS）原料的紫外扫描曲线完全不同，这是由于COS与苯并吡喃类衍生物酸及取代苯并吡喃类衍生物酸发生加成反应后的紫外吸收峰与原料壳寡糖相比有了改变。
这进一步证实了壳寡糖与苯并吡喃类衍生物酸及取代苯并吡喃类衍生物酸发生了化学反应。
3.2.2红外吸收分析
图3.14是壳寡糖（COS）及苯并吡喃基壳寡糖衍生物的红外光谱图，图3.15、3.16、3.17、3.18分别为壳寡糖的红外光谱图、氯代苯并吡喃基壳寡糖的红外光谱图、硝基苯并吡喃基壳寡糖的红外光谱图、3,5-二氯代苯并吡喃基壳寡糖的红外光谱图。
在COS的红外谱图中，3448cm-1是O－H伸缩振动，1414cm-1是苯环上C-Cl伸缩振动，1722cm-1是C－O伸缩振动；
在壳寡糖酰胺类衍生物的红外光谱中，725nm是C-伸缩振动，1528cm-1，1350，1528分别是N=O反对陈伸缩振动和对称伸缩振动，1708~1750cm-1是C=O的伸缩振动，并且在1450~1600cm-1附近出现了苯环的特征骨架振动吸收峰：
氯代苯并吡喃基壳寡糖1613cm-11523cm-11450cm-1；
硝基苯并吡喃基壳寡糖1617cm-11593cm-11527cm-11473cm-1；
3,5-二氯苯并吡喃基壳寡糖1625cm-11600cm-11550cm-11475cm-1。
这些新峰均是由3种苯并吡喃甲酸与COS反应生成的苯并吡喃基壳寡糖衍物所产生的。
特别是C-X和-C=O吸收峰的出现，也证实了制备的酸与壳寡糖发生了反应。
图3.14壳寡糖（COS）及苯并吡喃基壳寡糖衍生物的红外光谱图
1:
壳寡糖2:
氯代苯并吡喃基壳寡糖3:
硝基苯并吡喃基壳寡糖4：
3,5-二氯苯并吡喃基壳寡糖
图3.15壳寡糖的红外光谱图
图3.16氯代苯并吡喃壳寡糖
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